Repositório RCAAP

A lesão de isquemia-reperfusão (IR) hepática é uma complicação inevitável durante a cirurgia hepática, causada pela interrupção do fluxo sanguíneo e subsequente inflamação durante a revascularização do fígado. Uma vez que esta condição patológica tem uma alta taxa de mortalidade associada, há um interesse crescente na investigação de métodos e estratégias para prevenir e atenuar a IR hepática. A IR hepática é caracterizada por uma fase de isquemia, em que a falta de oxigénio e a depleção de ATP leva à interrupção da microcirculação e ao dano mitocondrial, e uma fase de reperfusão, distinguida pela ativação do sistema imunológico do fígado que envolve ativação de macrófagos e neutrófilos, produção de citocinas e quimiocinas, stress oxidativo e aumento da expressão de moléculas de adesão no endotélio hepático. Os mecanismos de resolução de inflamação no fígado são conhecidos uma vez que alguns mediadores anti-inflamatórios são capazes de induzir a cicatrização do tecido hepático e a proliferação de hepatócitos. O sistema hepatobiliar é responsável por diversos processos metabólicos, incluindo formação e secreção biliar, desintoxicação e metabolismo do glicerol. Como a bile é predominantemente composta por água, a formação de bile canalicular é um processo de secreção osmótica que resulta da entrada de água em resposta a gradientes osmóticos criados pela secreção activa de solutos. Quando os hepatócitos são estimulados, o transporte de água ocorre significativamente pela via transcelular através da membrana plasmática. Foi demonstrado que várias células do trato hepatobiliar expressam aquaporinas (AQPs), pequenas proteínas transmembranares conhecidas por auxiliar no transporte transmembranar de água, aumentando a permeabilidade à água e também permitindo o transporte de glicerol e outros pequenos solutos. Além disso, como durante a revascularização do fígado a permeabilidade da membrana é afectada por processos de inflamação, as AQPs situadas em várias células do fígado representam importantes reguladores do equilíbrio hemodinâmico durante a IR. Considerando o papel que as AQPs podem desempenhar durante os processos de IR do fígado, o foco deste trabalho consistiu em avaliar o efeito da IR na expressão de AQPs. O ensaio in vitro com células HepG2 expostas a diferentes estímulos de IR permitiu distinguir o efeito da inflamação do estímulo de hipoxia na expressão de AQPs. Mediante estímulo de inflamação com LPS, as células induziram a expressão de AQPs a fim de restabelecer a homeostase e atenuar os processos biológicos instigados pela sobre-expressão de mediadores da inflamação. Opondo-se à resposta inflamatória, mediante estímulo de isquemia, as células submetidas a uma câmara de hipoxia suprimem a expressão de AQPs como um mecanismo de prevenção de influxo de água nas células e manutenção da homeostase da água durante o processo inflamatório inicial e prevenção de edema celular. Além disso, a administração de formulações lipossomais de fármacos demonstrou ser eficaz na atenuação dos processos de inflamação causados pela exposição das células HepG2 a compostos tóxicos e disfunções relacionadas à inflamação nas células do fígado, já que ambos os fármacos testados (prednisolona e ibuprofeno) mostraram efeitos favoráveis na reversão da inflamação induzida por LPS, diminuindo significativamente a expressão de AQP3 e citocinas. O ensaio in vivo do efeito de IR em células de fígado de rato permitiu delinear um perfil de expressão de AQPs ao longo dos diferentes tempos do processo de IR. As células suprimiram significativamente a expressão de AQPs após 2h de reperfusão, a fim de se opor aos mecanismos decorrentes do processo de isquemia e evitar o influxo de água na célula e edema celular nas primeiras horas de reperfusão, então induziram a expressão de AQPs após 6h de reperfusão a fim de restabelecer homeostase da água e, finalmente, após 24h de reperfusão as células aumentaram a expressão de AQPs. Como a expressão de AQPs e TNF-ɑ após 24h de reperfusão se assemelhava à condição de normóxia, este ensaio confirmou que após 24h de reperfusão as células passam por processos de resolução da inflamação e retornam à homeostase. Além disso, o tratamento com o composto natural quercetina foi ineficiente em atenuar os processos de inflamação induzidos por IR, pois os perfis de AQPs assemelham-se às amostras sem tratamento. Apesar disso, a administração intravenosa de quercetina lipossomal (formada por SPC) apresentou maior expressão de AQPs do que a administração intraperitoneal de quercetina lipossomal (formada por EPC). Para uma melhor avaliação do papel das AQPs nos mecanismos de IR do fígado, devem ser realizados ensaios funcionais e, em última análise, devem ser investigadas estratégias para direcionar e regular as AQPs durante a IR do fígado com o objetivo de reduzir a alta taxa de mortalidade associada a essa condição.

The access of adult learners of a second language (L2) to Universal Grammar (UG) has been widely studied in generative L2 acquisition research. Following the Representational Deficit Hypothesis (RDH), certain features not available in the native language (L1) are not accessible in adult L2 acquisition (Hawkins, 2005; Tsimpli & Dimitrakopoulou, 2007, among others). On the contrary, according to the Feature Reassembly Hypothesis (FRH), adults can access UG to acquire configurations that are not present in their L1 nor in the explicit input (e.g. Lardiere, 2008; Slabakova, 2016). This dissertation aims at contributing to this debate through the study of the L2 acquisition of prepositional relative clauses (RCs) in European Portuguese (EP) by Mandarin Chinese (MC) native speakers. EP displays wh-movement in prepositional RCs formed with standard Pied-Piping (PiP) and non-standard P-Chopping (P-Chop). Non-standard resumptive RCs do not involve movement (Alexandre, 2000). In MC, prepositional RCs involve a mandatory resumptive pronoun (RP), without movement. P-Chop is also attested in the L2 acquisition of prepositional RCs and wh-questions (Klein, 1993; Jourdain, 1996; Perpiñán, 2010), being analyzed as a developmental stage (Perpiñán, 2010, 2020) or evidence of a wild grammar (Klein, 1993). In MC, prepositional RCs display a mandatory resumptive pronoun (Pan, 2016a, 2016b, a.o.), not involving movement (Wen, 2020). The main goals of this dissertation are to understand if MC learners of EP L2: 1) transfer resumption from the L1 into the L2; 2) can acquire new functional features or reorganize (reassemble) L1 features to configure wh-movement in the L2, producing and accepting PiP and P-Chop RCs; 3) show a developmental path in the acquisition of prepositional RCs. To achieve these goals, an oral production task and two self-paced reading acceptability judgement tasks (SPR-AJTs) were used. One SPR-AJT targets relativization strategies and the other focuses on the learner’s implicit knowledge of wh-movement, both contrasting argument and adjunct prepositional RCs. Intermediate (n=36) and advanced (n=36) native MC learners of EP L2, and native EP speakers (N=30) participated in this study. Results show that: 1) learners do not transfer resumption from their L1; 2) both groups of learners produce and accept preferentially PiP RCs; 3) intermediate learners have larger percentages of production of P-Chop with adjuncts than advanced learners; 4) in island configurations, argument RCs are rated worse than adjunct RCs; and 5) RPs do not rescue islands for any group. Overall, these results support the FRH, indicating that L2ers are able to acquire the features that trigger wh-movement, producing PiP and P-Chop. The results also corroborate that P-Chop exists as a developmental stage (Perpiñán, 2010, 2020), with distinct properties from P-Chop in native EP, arguing against previous research that treats P-Chop as evidence of a wild grammar (e.g., Klein, 1993). Finally, the results with syntactic islands challenge the idea that RPs improve these structures in both native and non-native grammars. The convergence between EP natives and Chinese speakers rejecting argument RCs more assertively than adjunct RC also indicates that adult Chinese learners are sensitive to the same grammatical constraints and processing principles of native speakers, and that L2 learners are able to reassemble the wh-features accordingly.

Os perturbadores endócrinos são substâncias exógenas químicas que alteram o funcionamento do sistema endócrino e podem causar efeitos adversos na saúde de um organismo, na descendência, ou na população. Existem vários regulamentos da UE que avaliam o risco de exposição a estas substâncias químicas perigosas, com o objetivo de garantir a proteção da saúde humana e ambiente. Alguns regulamentos da UE têm medidas especificas para substâncias perturbadoras endócrinas como o regulamento do REACH, regulamento dos produtos biocidas e regulamento dos produtos fitoterapêuticos. Outros regulamentos, como o regulamento dos produtos cosméticos, não têm medidas especificas para a avaliação de substâncias perturbadoras endócrinas. Nos regulamentos da UE é possível observar diferenças na definição de critérios para identificação de perturbadores endócrinos e na avaliação destas substâncias. Existe uma dificuldade em decidir se esta avaliação deve ser feita usando uma abordagem com base no perigo ou uma abordagem com base no risco. A dificuldade na avaliação de substâncias perturbadoras coloca-se quando não é possível definir se existe um limiar de segurança ou determinar o nível de exposição em determinados grupos etários. Para os produtos cosméticos o desafio é ainda maior devido à proibição de testes em animais, salvo exceções contempladas pelo REACH, e também à não existência de métodos suficientes de testes validados pela OCDE que consigam avaliar os vários caminhos críticos metabólicos. Desta forma coloca-se a questão de qual deverá ser a regulamentação a aplicar a perturbadores endócrinos nos cosméticos. Com o objetivo de simplificar e consolidar a definição de critérios para a identificação de perturbadores endócrinos é essencial seguir uma abordagem horizontal em toda a regulamentação da UE. Para isto, é importante como primeiro passo, a criação de uma nova classe de perigo, classe “substâncias perturbadoras endócrinas” no regulamento CLP. Este passo vai permitir que existam alterações de simplificação nos restantes regulamentos da UE de forma a que todos contribuam para a manutenção da segurança química na Europa. Assim, o regulamento dos produtos cosméticos terá que contemplar alterações, através da criação de um artigo especifico que indique que substâncias perturbadoras identificadas na parte 3 do Anexo VI do regulamento do CLP sejam proibidas de serem utilizadas em produtos cosméticos. A exceção estará relacionada com uma avaliação pelo CCSC que irá, caso a caso, avaliar o risco de exposição e a identificação da existência de um limiar de segurança. Esta avaliação irá permitir que as substâncias sejam incluídas nas listas negativas ou positivas do regulamento dos cosméticos. Em suma, existem pontos de melhoria no trabalho da CE para a simplificação, consolidação e harmonização de critérios de identificação de substâncias perturbadoras endócrinas, nas abordagens de avaliação, e no desenvolvimento e validação de métodos de testes alternativos. Adicionalmente, é crucial continuar a desenvolver métodos de testes alternativos validados que permitam identificar e avaliar todos os caminhos metabólicos e endpoints, principalmente no regulamento dos produtos cosméticos onde existe a proibição de testes em animais. Estes pontos de melhoria vão facilitar o desenvolvimento de novos produtos cosméticos e simplificar a avaliação pelos reguladores.

A doença inflamatória do intestino integra um conjunto de doenças idiopáticas que envolvem a inflamação crónica do trato gastrointestinal, nomeadamente a colite ulcerosa (UC), a doença de Crohn (CD) e a colite de origem indeterminada (IC). A DII é motivo de preocupação crescente na sociedade atual, verificando-se nos últimos anos um aumento exponencial da sua incidência, quer nos países em desenvolvimento quer nos países desenvolvidos. A abordagem terapêutica usual para a DII engloba a terapia farmacológica, onde se incluem os aminossalicilatos, corticosteroides, antibióticos e imunomoduladores, bem como agentes anti-TNF-α, sendo constante o esforço para desenvolvimento de novos fármacos mais eficazes no tratamento deste conjunto de patologias, reforçando-se a necessidade de uma mudança no paradigma da terapêutica farmacológica e a utilização de novas abordagens terapêuticas tais como o recurso a transplante fecal, a administração de probióticos e/ou de prebióticos, e de plantas medicinais e suas preparações no tratamento destas patologias. O presente trabalho tem por objetivo contribuir para o conhecimento da utilidade concreta das plantas medicinais, na prevenção, remissão ou como coadjuvante da remissão da DII, através da realização de uma revisão sistemática da literatura científica disponível nos últimos 25 anos, usando a metodologia PRISMA. De um número inicial de 398 artigos científicos, obtidos por pesquisa bibliográfica nas bases de dados PubMed, Scopus e Cochrane Library, foram selecionados 14 estudos científicos e nestes identificadas 12 plantas medicinais: Aloe vera, polpa da folha, Andrographis paniculata, folha, Artemisia absinthium, folha e caule, Boswellia serrata, caule, Holarrhena pubescens, casca e semente, Linum usitatissimum, semente, Plantago ovata, semente, Punica granatum, casca, Tripterygium wilfordii, raiz, Triticum aestivum, rebento, Urtica dioica, folha e Zingiber officinalis, raiz. Entre estas plantas, 3 são já objeto de monografia quanto à sua segurança e eficácia, por parte da Agência Europeia de Medicamentos (EMA). Os estudos selecionados são promissores da utilidade destas plantas medicinais na Indução e na manutenção da Remissão da DII. No entanto serão necessários mais estudos clínicos, com recurso a métodos padronizados.

No final do ano de 2019, foi descoberto um novo vírus altamente contagioso ao qual se deu o nome de SARS-CoV-2, (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) o qual provoca a doença COVID-19. Mundialmente, a disseminação contínua de COVID-19 tornou-se um enorme problema de saúde pública com consequências sociais, económicas e políticas devastadoras. Devido ao seu recente surgimento, existe uma grande carência de informação sobre o seu comportamento e da resposta imune do hospedeiro. Esta tese tem como objetivo caracterizar a resposta(s) imune(s) desencadeada pelo SARS-CoV-2 numa coorte de doentes internados nos cuidados intensivos (CI) com COVID-19. Além disso, também pretendemos encontrar padrões associados à qualidade e amplitude das respostas imunes nestes doentes. Os participantes do estudo foram recrutados no Hospital Curry Cabral, em Lisboa, de 14 de março a 14 de junho de 2020. Todos os participantes elegíveis tinham uma infeção provocada por SARS-CoV-2, confirmada por RT-PCR, e caracterizada por uma evolução clínica grave, o que resultou na sua admissão na unidade de cuidados intensivos (UCI) do hospital. De forma a acompanhar a progressão da doença ao longo do tempo de internamento, foram colhidas amostras de sangue aproximadamente a cada 3 dias em cada doente. Além disso, de acordo com os níveis de CRP monitorizados no momento de admissão nos cuidados intensivos, os doentes foram estratificados de acordo com o estado clínico em doentes graves (CRP<200µg/mL) ou doentes críticos (CRP>200µg/mL). Inicialmente, analisámos a resposta humoral mediada por anticorpos entre os dois grupos de doentes. Ao analisarmos os títulos de IgG e IgM específicos para a proteína spike S1, S2 e para a nucleocapside, não observamos diferenças significativas entre os 2 grupos, durante o tempo de permanecia nos CI. No entanto, foi possível observar que os títulos de anticorpos IgM e IgG específicos para a spike S1 eram mais elevados quando comparados com os títulos para a nucleocapside. O que sugere que a proteína spike é mais imunogénica do que a nucleocapside, e que os anticorpos contra esta proteína têm um papel importante na eliminação viral e na recuperação dos doentes. Curiosamente, não detetamos níveis de anticorpos IgG e IgM específicos para a subunidade S2, mostrando a baixa imunogenicidade desta subunidade da proteína spike. Na admissão aos cuidados intensivos, os níveis de anticorpos IgG anti-spike S1 e anti-nucleocapsíde estavam 4 e 2 vezes aumentados, respetivamente, em relação ao background do ensaio de ELISA. No entanto, os títulos de anticorpos IgG continuaram a aumentar até aproximadamente ao 6º dia após a admissão, onde atingiram o plateau. Relativamente aos níveis de anticorpos IgM, estes permaneceram constantes durante o tempo de internamento no UCI. Os níveis de IgM específicos para a Spike S1 estavam 2 vezes aumentados relativamente ao cutpoint, enquanto os níveis de IgM específicos para a nucleocapsíde estavam próximos do cutpoint. Relativamente, aos níveis de anticorpos IgA específicos para a S1 e para a N, observámos uma grande variação entre os dois grupos CRP-estratificados. Os títulos de anticorpos IgA aumentaram até atingir um pico por volta do 6º dia após a admissão na UCI, mas rapidamente decresceram até valores próximo do background do ensaio. Em contraste, a variação nas respostas de anticorpos foi extremamente díspar nos doentes críticos. Enquanto alguns doentes apresentavam uma resposta semelhante à observada nos doentes graves, outros não apresentavam qualquer resposta. Em suma, o perfil cinético da resposta dos anticorpos observado neste estudo é consistente com o reportado em estudos anteriores. No entanto, é possível observar variações temporais na cinética das respostas entre os vários estudos. É ainda importante notar que os doentes que sucumbiram ao COVID-19 não desenvolveram elevados títulos de anticorpos contra as várias proteínas SARS-CoV-2 testadas (Spike S1, S2 e Nucleocapsíde). Nos primeiros dias após entrada no UCI foi possível detetar títulos de anticorpos neutralizantes (NAbs), porém esses títulos eram relativamente baixos. Destaca-se um aumento ligeiro nos títulos de NAbs nos doentes graves em relação aos doentes em estado crítico. Em ambos os grupos, os títulos de NAbs atingiram o seu pico aproximadamente ao 6º dia após a admissão na UCI, permanecendo estáveis durante o restante período de internamento. De forma geral, os doentes graves apresentaram uma resposta cinética para os anticorpos neutralizantes idêntica à dos doentes críticos, contudo apresentaram sempre níveis de NAbs ligeiramente superiores. É, no entanto, de notar que os doentes que morreram não desenvolveram títulos de NAbs ou o seu surgimento foi tardio, sugerindo que as respostas de anticorpos contra SARS-CoV-2 desempenham um papel essencial na sobrevivência à COVID-19. Foi ainda possível notar que os níveis de NAbs estão fortemente correlacionados com os níveis de anticorpos IgG, mas não com as restantes classes IgM e IgA. Estudos anteriores demonstraram que os anticorpos neutralizantes direcionados para o domínio de ligação ao recetor (RBD) são imunodominantes durante as infeções por SARS-CoV-2. Com base nessas observações, decidimos estudar a reatividade das amostras de plasma dos doentes COVID-19 contra os epítopos do RBD do SARS-CoV-2. Observámos, pela primeira vez, a existência de dois clusters de peptídeos, cluster 1 e cluster 2, nos quais a reatividade das amostras de plasma de doentes foi superior. Ao comparar a reatividade entre os dois clusters foi possível observar que o cluster 2 apresentava reatividade superior em relação ao cluster 1. Curiosamente, ao analisar a localização dos clusters na estrutura tridimensional da proteína spike do SARS-CoV-2, vemos que o cluster 2 está localizado no local de interação do RBD com o seu recetor, o ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2), em contraste com o cluster 1, que está localizado no local oposto. Estas observações sugerem que os anticorpos direcionados a estes clusters, particularmente ao cluster 2, são mais prováveis de possuírem uma atividade neutralizantes. Ao analisar a resposta entre doentes graves e críticos não foi possível encontrar diferenças significativas na imuno-reatividade dos peptídeos. No entanto, foi possível perceber que em ambos os grupos, alguns doentes exibiam um padrão distinto de reatividade para os diversos epítopos do RBD. Esses resultados sugerem que a progressão da doença não está inteiramente associada aos títulos e ao alvo dos anticorpos, mas também a outros mecanismos da resposta imune, como a resposta inflamatória mediada por citocinas. Foi ainda possível observar um aumento da reatividade ao longo do tempo de internamento em quase todos os doentes, sendo consistente com as melhorias observadas dos doentes. No entanto, mais estudos são necessários para confirmar a capacidade neutralizante dos anticorpos direcionados a esses dois clusters. Por último, mostrámos que a assinatura COVID-19 foi caracterizada por um aumento dos níveis de várias citocinas inflamatórias e quimiocinas, das quais destacamos as seguintes: GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL- 6, IL-8, e MIP3a. Os doentes que não sobreviveram, revelaram um perfil de citocinas divergente, caracterizado ou por uma resposta exacerbada ou pela falta de resposta. Os resultados apresentados neste trabalho demostram que vários mecanismos da resposta imune do hospedeiro parecem estar implicados na imunopatogénese da COVID-19. Através da análise da resposta de anticorpos, podemos perceber que estes desempenham um papel importante na progressão e no desfecho clínico da COVID-19. Além disso, a análise da assinatura de citocinas pode dar orientações aos profissionais de saúde para modular a resposta imune inflamatória no estágio inicial da doença, evitando assim trajetórias clínicas graves e até a morte.

A presente dissertação teve como principal objetivo explorar a importância do andrografolido, um diterpeno com o esqueleto ent-labdano, como protótipo na descoberta de novos agentes antibacterianos de origem natural, nomeadamente contra bactérias multirresistentes, um problema grave de saúde pública. Assim, neste trabalho foi preparada uma biblioteca de vinte e seis derivados de andrografolido, um dos principais constituintes da espécie Andrographis paniculata (Acanthaceae), por transformações químicas, incluindo a preparação de cinco novos carbamatos, a partir de isocianatos. Algumas outras transformações efetuadas envolveram reações de acetilação e isomerização, formação de acetais nos hidroxilos em C-3 e C-19, bem como a preparação de um novo derivado contendo a função carbamato, usando 1,1'-carbonildiimidazole. Foi também realizada a remoção do grupo hidroxilo C-14 para posterior derivatização. A partir do composto resultante, foram preparados novos carbamatos, usando isocianatos e 1,1'-carbonildiimidazole. A oxidação e acilação do hidroxilo em C-3, bem como a alquilação do hidroxilo em C-19 também foram efetuadas. Os compostos foram caracterizados por espectroscopia de infravermelho (IV), espectrometria de massa e por experiências de Ressonância Magnética Nuclear (NMR) unidimensional (1H NMR e 13C NMR e DEPT) e bidimensional (HSQC, HMBC, NOESY e COSY). Os compostos sintetizados foram avaliados quanto à sua atividade antibacteriana, pelo método da microdiluição em meio líquido, contra um painel de bactérias Gram-positivas, nomeadamente Staphylococcus aureus ATCC 6538, S. aureus resistente à meticilina (MRSA) ATCC 43866, S. aureus intermediário de vancomicina (VISA) ATCC 106766, S. epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecalis ATCC 11420, E. faecalis resistente à vancomicina (VRE) ATCC 51299 e Mycobacterium smegmatis ATCC 607 e as bactérias Gram-negativas Salmonella typhimurium ATCC 13311 e Escherichia coli ATCC 8739. Para avaliar a atividade antibacteriana, procedeu-se à determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de todos os compostos e da concentração mínima bactericida (CMB) dos compostos com maior atividade antibacteriana. O composto que exibiu maior atividade foi o 3,14,19-triacetil andrografolido (1.18), que mostrou uma atividade antibacteriana significativa (valores de CMI de 7 μg/mL em VISA ATCC 106766 e 15 μg/mL em S. aureus ATCC 6538, MRSA ATCC 43866 e VRE ATCC 51299). Outros compostos com atividade antibacteriana relevante foram os derivados 2.1, 2.2 e 2.4, contendo fenil carbamatos em C-14 e C-19 (valores de CMI entre 15-60 μg/mL contra as mesmas estirpes que o composto 1.18). Determinou-se também que a atividade antibacteriana destes quatro derivados é como bacteriostáticos.

O fígado gordo não-alcoólico (FGNA) é uma doença metabólica crónica, caracterizada pela acumulação excessiva de gordura no fígado, muitas vezes resultante de uma dieta rica em gorduras e calorias, e associando-se com a diabetes de tipo 2. Durante os últimos anos, a taxa de incidência do FGNA cresceu de forma significativa, atingindo um quarto da população mundial adulta em 2016, sendo expectável que esta tendência se mantenha. O FGNA é caracterizado pela presença de lesões hepáticas, desde a esteatose simples até à esteatohepatite não alcoólica (EHNA), podendo mesmo progredir para fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Ainda que a patogénese da doença não seja bem conhecida, pensa-se que seja uma doença bastante complexa e multifatorial, influenciada por vários fatores, incluindo fatores genéticos, idade, sexo, e estilo de vida. É de notar que a doença se caracteriza por uma fase precoce assintomática e, por isso, o diagnóstico ocorre numa fase mais tardia. Apesar da reversibilidade da doença, não existem tratamentos pré-estabelecidos na prática clínica. Não obstante, durante os últimos anos, têm sido identificados vários mecanismos que desempenham um papel no desenvolvimento e na progressão do FGNA, sugerindo vários alvos possíveis para o diagnóstico e para a terapêutica. Os microRNAs são pequenos RNAs endógenos não codificantes que atuam como reguladores da tradução de vários genes. Foi já demonstrado que vários microRNAs se encontram desregulados nos doentes em diversos estadios do FGNA, evidenciando o seu papel potencial quer no diagnóstico quer na terapêutica. Vários grupos de investigação, incluindo o nosso, já demonstraram a ocorrência da regulação positiva do microRNA-21 (miR-21) no fígado, nos músculos e no soro de pacientes com FGNA. Os nossos estudos demonstraram que a regulação negativa do miR-21 em ratinhos alimentados com dietas deficientes em metionina e colina provocou uma redução significativa na ocorrência de fibrose hepática, esteatose, e inflamação. De forma semelhante, a deleção do miR-21 hepático resultou na prevenção da intolerância à glucose e da esteatose em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gorduras. Também foi demonstrado que a desregulação de recetores nucleares ativados por ácidos biliares, particularmente do recetor X dos farnesóides (FXR) e do recetor 5 acoplado a proteínas G (TGR5), desempenha um papel importante na patogénese do FGNA. Ratinhos com defiência no FXR alimentados com uma dieta rica em gorduras desenvolveram manifestações patológicas da EHNA, enquanto que ratinhos knockout da SHP-1, um alvo ajusante do FXR, não desenvolveram quaisquer manifestações clínicas de esteatose hepática. Além disso, o nosso grupo demonstrou também que a ativação do recetor FXR através de indução pelo ácido obeticólico em simultâneo com a inibição do miR-21 em ratinhos alimentados com uma dieta “fast-food” preveniu significativamente a progressão da doença, incluindo a restauração do metabolismo lipídico no fígado. Por outro lado, outros autores demonstraram que a ativação do TGR5 resulta num decréscimo da produção de citocinas pró-inflamatórias, na sobreexpressão do GLP-1 e numa melhoria da esteatose hepática e da sensibilidade à insulina. Nesse sentido, o INT-767, um agonista duplo dos recetores FXR e TGR5, tem vindo a ser investigado como um potencial agente terapêutico para o tratamento do FGNA. Em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gorduras, o INT-767 foi capaz de melhorar o metabolismo lipídico e da glucose, a sensibilidade à insulina, a aterosclerose e a resposta inflamatória. O objetivo principal deste trabalho foi elucidar se o silenciamento do miR-21, através do uso de um inibidor sintético especifico - antagomiR-21 -, e/ou a ativação dos recetores FXR e TGR5, usando o agonista duplo INT-767, demonstram um efeito curativo no tratamento do FGNA, prevenindo a progressão da doença. Ratinhos C57BI/6J com 3 semanas foram alimentados com uma dieta rica em gorduras e deficiente em colina (HFCD), ou com uma dieta controlo, durante 12 semanas. Após este período, os ratinhos demonstraram evidência de esteatose hepática. Neste ponto, os ratinhos foram injetados com o antagomiR-21 e/ou tiveram a sua dieta suplementada com o INT-767, durante 12 semanas adicionais. Às 24 semanas, os ratinhos foram sacrificados e os tecidos hepático e adiposo, assim como o soro, foram recolhidas e processados para a realização de testes histológicos, bioquímicos e moleculares. A expressão de proteínas e genes envolvidos em várias vias de sinalização do FGNA, assim como de vias ajusante dos recetores nucleares, foi avaliada através de técnicas de Western blot, ELISA, e qRT-PCR. Além disso, a expressão de uma seleção de genes envolvidos no cancro do fígado foi analisada através de técnicas de microarray por qRT-PCR . Os resultados obtidos demonstraram que o tratamento com o antagormiR-21 e o INT-767, de forma isolada ou simultânea, resultou numa melhoria das manifestações clínicas da doença do FGNA, induzidas pela dieta HFCD. Ambos os tratamentos, isolados e combinados, levaram a uma prevenção parcial do ganho de peso, normalização dos niveís séricos de enzimas relacionadas com dano hepático, e prevenção do desenvolvimento de características histopatológicas da doença. O tratamento com antagomiR-21 e/ou o INT-767 diminuiu significativamente a expressão do microRNA endógeno miR-21 no fígado. Em paralelo, observou-se um aumento da atividade dos recetores FXR e TGR5, demonstrado através da análise dos seus alvos ajusante SHP-1 e CYP7a1; e PKAc-α, respetivamente. É de notar que a expressão proteica de ambos os recetores FXR e TGR5 no fígado demonstrou ser positivamente regulada após os tratamentos, possivelmente como resultado da melhoria geral na saúde dos animais. O tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, tanto de forma isolada como em combinação, reverteu vásrias desregulações metabólicas relacionadas com o FGNA, agindo frequentemente em sinergia. A expressão hepática da PPARα, uma proteína que nosso grupo já demonstrou melhorar o FGNA, demonstrou ser regulada negativamente e de forma significativa em ratinhos não tratados, alimentados com uma dieta HFCD, e positivamente em ratinhos na dieta mas tratados com o antagomiR-21 e/ou o INT-767. Curiosamente, apesar de termos previamente demonstrado que a PPARα é um alvo do miR-21, esta proteína sofreu uma regulação positiva mais significativa após o tratamento com o INT-767. Além disso, o tratamento combinado demonstrou ter um efeito sinergístico. O FGF-21, um regulador da homeostase dos glicolipídos, muitas vezes estimulado pela PPARα, mostrou ser regulado positivamente, quer no soro quer no fígado, pelo tratamento com o INT-767, de forma isolada ou em combinação com o antagomiR-21. O tratamento com o antagomiR-21 e/ou INT-767 resultou ainda numa diminuição da desregulação mitocondrial, se bem que com efeitos sinergísticos reduzidos. É de notar que a expressão hepática do NRF2, uma proteína com papel inibidor da esteatose hepática, demonstrou manter-se inalterada em ratinhos alimentados com a dieta HFCD em comparação com os ratinhos na dieta controlo. Ainda assim, a expressão hepática do NRF2 aumentou significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou com o INT-767. A expressão da proteína mitofusina-2, uma proteína essencial à fusão mitocondrial, aumentou significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, quer de forma isolada ou combinada. Em paralelo, a expressão heática da DRP1, uma proteína essencial à fissão mitocondrial, diminuiu significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT767. Além disso, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 resgatou a regulação positiva da expressão hepática das proteínas apoptóticas caspase-2 e -3, induzida pela dieta HFCD, demonstrando um pequeno efeito sinergístico em ambos os casos. Também a via de sinalização da insulina foi afetada em ratinhos alimentados com a dieta HFCD, que exibiram aumento da fosforilação da proteína JNK, comparando com ratinhos na dieta controlo. Por sua vez, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 reduziiu os niveís de ativação do JNK. Os animais alimentados com a dieta HFCD exibiram ainda niveís reduzidos de fosforilação das proteínas IRS1 e Akt, comparando com os animais controlo, enquanto que os tratamentos com o antagomiR-21 e o INT-767, sozinhos ou em combinação, reverteram quase por completo a inativação destas proteínas. A análise da expressão génica de genes selecionados no tecido adiposo visceral correlacionou-se com os resultados previamente obtidos no tecido hepático. Em particular, a expressão da PPARα foi inibida em ratinhos alimentados com a dieta HFCD, comparando com os ratinhos na dieta controlo, mas resgatada após o tratamento com antagomiR-21 e/ou INT767. De forma semelhante, a expressão da SHP-1 e do TGR5 foi resgatada após o tratamento. A expressão da FABP4, normalmente aumentada em resposta à acumulação de lípidos, foi inibida significativamente por ambos os tratamentos. Finalmente, ratinhos alimentados com a dieta HFCD evidenciaram ainda a activação de vias de sinalização oncogénicas no fígado, cujo padrão de expressão foi aproximado dos ratinhos controlo após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767. No seu conjunto, os resultados obtidos nesta Tese demonstram que o antagomiR-21 e/ou o INT-767 revertem a desregulação hepática do metabolismo lipidico e da função mitocondrial, reduzindo simultâneamente o ambiente pró-inflamatório e a apoptose. O tecido adiposo visceral sofreu igualmente uma melhoria metabólica em ratinhos alimentados com a dieta HFCD mas tratados com uma ou ambas as estratégias terapêuticas em estudo. Além disso, ambos os tratamentos resultaram na regulação negativa de vários genes associados ao cancro do fígado. Em conclusão, o tratamento isolado com o INT-767 ou o antagomiR-21 previnem a progressão do FGNA. Além disso, o tratamento combinado foi mais eficiente no resgate das desregulações metabólicas e na prevenção da ativação de vias de sinalização oncogénicas, devendo por isso ser considerado como uma estratégia terapêutica putativa para o FGNA e o desenvolvimento de cancro associado ao FGNA.

Kathy Acker (1937-1997) was a celebrated experimental writer, who found a striking degree of commercial and critical success in the mid-1980s. Born and primarily based in the U.S., Acker managed to trace a creative and professional trajectory across the Atlantic, becoming an esteemed author - and often, a minor celebrity - both in the U.S. and in the U.K. Her book-length, novelistic experiments challenged the tenets of the contemporary novel, powerfully subverting encoded expectations and dominant definitions of narrative form, of authorial intent, and of literary creativity. Often grouped with post-modernist contemporaries, Acker's work both expresses something of that historical moment and surprises its convened temporality, producing imaginative pathways across various counter-traditions of innovative and oppositional literature. Variously described as pornographic, feminist, plagiaristic, violent, transformative, queer, punk, bad or derivative, her writing holds a compelling force of its own, and attests to a distinctive ethos of transgression. This project departs from extant understandings of Acker's work and the various ways it has been valued and rememorated across time - especially as the anniversary of both her birth and her death was celebrated in 2017. Recognizing these more recent processes of recollection and rememoration across various media and discursive contexts, this project unequivocally situates itself amidst an ongoing reassessment of the capacities and potentialities of Acker's body of work. However, unlike most contemporary discussions of Acker's writing, this project holds that her standing as a radically committed writer demands increased – rather than decreased – scrutiny into the more normative impulses of her work. While emphasizing the multiple ways her writing disrupted normalized structures of meaning and understanding, we must also probe into those moments where it reiterated, repeated, and reasserted the political fictions of hegemony and dominion. Three categories prove indispensable to this confrontation with the defining limits of Acker’s work: race, gender, and sexuality. With a strong intersectional emphasis, the present project suggests readings of three of Acker's novels: Kathy Goes to Haiti (1978), Blood and Guts in High School (1984) and Empire of the Senseless (1988). Tracing a comparative critical trajectory across the three texts, it evinces the inevitable contradictions of Acker's writing, and attempts to widen the scope of present conversations about the politics and poetics of her work.

O consumo de produtos biológico tem vindo a aumentar ao longo dos anos. Os consumidores optam por estes produtos com o objetivo de adotarem uma alimentação mais saudável, que tenha impactos positivos na sua saúde e no meio ambiente. O trabalho desta dissertação foi desenvolvido em duas fases. Uma primeira em que foi analisada a legislação europeia e a nacional e foram analisados os rótulos de 130 amostras de géneros alimentícios provenientes de produções biológicas. Verificou-se que a legislação não está a ser totalmente cumprida. Numa segunda fase foi disponibilizado um questionário sobre o consumo e rotulagem de produtos biológicos, através da plataforma Google Forms. A análise dos resultados permitiu concluir que os consumidores não estão esclarecidos relativamente a um produto biológico e que não estão devidamente informados de como podem identificar um produto biológico recorrendo à consulta do rótulo.

O objetivo principal da tese é contribuir para a implementação e avaliação de medidas de controlos de contaminação cruzada e de contenção do produto para se iniciar a produção de medicamentos citotóxicos parentéricos na nova instalação (Hikma 4 – Fábrica de Alta Contenção). Este projeto foi desenvolvido dentro de uma equipa multidisciplinar, cujo principal objetivo era implementar o processo de produção de medicamentos citotóxicos liofilizados. A Hikma 4 foi construída com o propósito de produzir produtos potentes, como os medicamentos parentéricos citotóxicos. Estes medicamentos são utilizados para o tratamento do cancro e são conhecidos por terem efeitos genotóxicos, mutagénicos, teratogénicos e carcinogénicos nos operadores que estão em contactos com estes produtos. Por essa razão, a produção de medicamentos citotóxicos requer uma instalação com estratégias de contenção do produto para proteger os operadores envolvidos e o meio envolvente. Para além disso, medicamentos parentéricos requerem um elevado nível de controlo ambiental no processo de produção de forma a minimizar os riscos de contaminação por microrganismos, partículas e pirogénios. A esterilidade é um atributo importante do produto final que deve ser controlado até ao final do processo. O início deste trabalho consiste numa extensa revisão de literatura de todo o processo de produção de medicamentos citotóxicos liofilizados e das tarefas adjacentes a esta produção. A legislação atual foi revista para compreender o processo de fabrico e os controlos definidos pelas diretrizes para proteger o produto, operador e meio envolvente. Atualmente, a legislação relacionada com os medicamentos citotóxicos em ambiente industrial encontra-se vaga e por essa razão este projeto focou-se na transferência de conhecimento e informação para a aplicação real de procedimentos implementados na Hikma 4. O seguinte capítulo corresponde a uma transposição da informação contida nas diretrizes oficiais e na implementação das mesmas no contexto real da Hikma. As estratégias implementadas envolvem procedimentos relacionados com as instalações, com o processo de fabrico propriamente dito e com os operadores que se encontram envolvidos desde o momento em que as matérias-primas necessárias para a produção do lote são transferidas para se iniciar a produção de um novo lote de medicamentos citotóxicos. A fábrica foi desenhada de forma a evitar a contaminação cruzada e proteger a esterilidade do produto final. Os fluxos de pessoas, materiais e componentes estão definidos para que não haja contaminação e para que o produto final seja entregue ao armazém com qualidade. O processo de produção de medicamentos citotóxicos liofilizados tem diversas etapas, entre elas, preparação de lote, enchimento, liofilização e capsulagem, que foram analisadas individualmente. Em cada uma das etapas foram implementadas estratégias de contenção do produto, como é o caso dos isoladores, e procedimentos de proteção do produto e dos operadores, como é o caso do equipamento de proteção individual. A produção de medicamentos citotóxicos será realizada por operadores treinados em todas as etapas de produção, incluindo, uso do equipamento de proteção individual e conhecimento dos procedimentos para contenção do produto e proteção do ambiente. Para além disso, foram definidos procedimentos para a ocorrência de derrames e tratamento de resíduos citotóxicos provenientes do processo de fabrico. Os resíduos citotóxicos sólidos e líquidos podem contaminar o meio ambiente e por essa razão devem ser deviamente tratados antes de estarem em contacto com qualquer tipo de material que não esteja contaminado. O seguinte capítulo deste projeto envolve a apresentação de uma avaliação de risco. Uma abordagem de gestão de risco foi implementada para avaliar os controlos implementados ao longo deste projeto para proteger tanto o produto, o operador e o ambiente envolvente. O conhecimento das medidas implementadas e da sua eficácia é essencial para identificar procedimentos críticos que necessitam de ser monitorizados ao longo do tempo. Desta forma é possível eliminar potenciais falhas que possam ocorrer durante o processo de produção e implementar, caso seja necessário, novas medidas de controlo. Em último lugar, são apresentadas as conclusões deste projeto e as perspetivas futuras, uma vez que após a inspeção realizada pelo INFARMED, a Hikma 4 encontra-se aprovada para iniciar a produção de medicamentos citotóxicos liofilizados. O objetivo deste trabalho foi alcançado com sucesso. Foram definidos e implementados procedimentos para evitar a contaminação cruzada e para conter o produto, protegendo tanto os operadores como o ambiente envolvente. Desta forma, foi dado mais um passo para se iniciar a produção de medicamentos citotóxicos na Hikma 4.

Esta dissertação encontra-se dividida em duas partes. Na primeira parte, são abordados os desafios existentes na globalização da serialização e na segunda parte é descrita a realização de um estudo de avaliação da implementação da Diretiva 2011/62/UE nas farmácias portuguesas A implementação da serialização de medicamentos pode reduzir a falsificação dos mesmos. Os medicamentos falsificados são medicamentos que existem no circuito do medicamento como reais e autorizados, mas que podem conter substâncias ativas ou excipientes em doses erradas ou de baixa qualidade, podem ser rotulados de forma fraudulenta ou conter embalagens falsas. A serialização identifica cada medicamento por um número de série único permitindo que seja rastreado em todo o seu ciclo de vida, desde o fabrico à dispensa ao utente. Na União Europeia, onde se inclui Portugal, foi implementada a Diretiva 2011/62/UE e, desde 9 de fevereiro de 2019, devem ser cumpridas por todas as entidades do circuito do medicamento as obrigações legais previstas no Regulamento Delegado (UE) 2016/161 da Comissão, incluindo a obrigatoriedade prevista na Diretiva da colocação de dispositivos de segurança (Identificador Único e dispositivo de prevenção de adulterações). Em Portugal, foi aceite a introdução de um período de transição para a serialização após a entrada em vigor do Regulamento Delegado (RD), de forma a assegurar o abastecimento contínuo e regular de medicamentos no mercado nacional. A serialização foi também implementada por países não pertencentes à União Europeia. Nesta dissertação são abordados alguns países e é realizada uma comparação com a legislação existente nesses países e na União Europeia. É ainda abordado o impacto do Brexit na aplicação da Diretiva 2011/62/UE no Reino Unido. A implementação da serialização nas empresas farmacêuticas é complexa e requer um envolvimento de todos os departamentos da empresa. Apesar da serialização ter trazido vantagens para a indústria farmacêutica, trouxe também alguns obstáculos, como por exemplo, os custos associados. Após a implementação da serialização de medicamentos na União Europeia, em 2017, novos regulamentos sobre dispositivos médicos foram adotados de forma a promover a transparência e rastreabilidade dos mesmos ao longo da cadeia de abastecimento, sendo necessária a identificação única do dispositivo médico segundo as orientações internacionais. O novo regulamento deveria ser implementado até 26 de maio de 2020, mas devido à atual pandemia COVID-19 e para evitar rutura de stocks ou atrasos na disponibilidade de dispositivos médicos, foi adiado por um ano. O estudo realizado para avaliação da implementação da Diretiva 2011/62/UE teve como principal objetivo avaliar se a verificação e desativação do identificador único presente nas embalagens de medicamentos está a ser realizada corretamente. Foi elaborado um questionário e enviado a todas as farmácias comunitárias em território nacional (Portugal continental e ilhas). Os resultados obtidos foram analisados e comparados com a informação recolhida das fontes consultadas. Conclui-se que a serialização veio combater efetivamente o problema dos medicamentos contrafeitos, continuando a ser necessário educar a população e os profissionais de saúde para a deteção e comunicação dos mesmos. Seria útil implementar um sistema de serialização para todos os medicamentos, mas a sua relação custo/benefício teria de ser bem analisada e poderia não ser positiva para países desenvolvidos que possuem uma cadeia de distribuição bem regulamentada. No entanto, a existência de uma significativa circulação de medicamentos falsificados em países em desenvolvimento revela a importância da implementação do sistema de serialização nesses países.

O crescimento do mercado biofarmacêutico, o interesse em formulações de liberação controlada (CR) combinado com a produção de micropartículas à base de polímero biodegradável, como o Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) têm sido amplamente estudado para o encapsulamento de biomoléculas. Neste trabalho, duas formulações para o encapsulamento da lisozima em microesferas PLGA foram desenvolvidas e otimizadas, bem como o processo de produção baseado na técnica dupla emulsão evaporação de solvente, água-em-óleo-em-água (W/O/W). Durante o desenvolvimento do processo, foi avaliado a morfologia, a eficiência de encapsulamento (EE), a atividade proteica e a liberação da proteína das microesferas. A produção da W/O/W consiste na emulsificação da primeira fase aquosa, que contém lisozima dissolvida, com a fase oleosa, solução de PLGA, e de seguida com a segunda fase aquosa. A tecnologia de produção utilizada foi um misturador de alto cisalhamento e um liofilizador. A combinação de PVA e NaCl na fase aquosa externa (W2) mostrou-se a melhor escolha como estabilizante da emulsão. As microesferas obtidas apresentam uma forma esférica, rígidas, o EE foi de ~ 100% e a atividade da proteína foi mantida. Durante as etapas de produção, a etapa de lavagem foi otimizada até a última etapa (stage 4) onde uma superfície limpa foi alcançada. A etapa de tempering, tempo necessário para a evaporação do solvente, é uma etapa crítica para a solidificação das microesferas, sem um tempo adequado nesta etapa as microesferas iram desfazer-se quando a etapa de lavagem fosse realizada. O desenvolvimento de uma nova formulação de libertação controlada requer meses de pesquisa e estudos de libertação in vitro (IVR) para atingir o perfil de liberação desejado do medicamento. Uma Wmaneira de reduzir esse tempo é tentar prever esses dados com o mínimo de tempo experimental usando modelos empíricos ou matemáticos. A equação de Weibull, modelo empírico, consegue prever o perfil de liberação do medicamento que é controlado pela erosão do polímero juntamente com uma explosão inicial de liberação mínima e uma liberação difusiva mínima, mas dados de IVR em tempo real e acelerados são necessários. O modelo matemático selecionado, uma framework analítica, para a previsão da libertação da substância ativa de microesferas de libertação controlada baseado em valores de parâmetros da matéria-prima e do produto final (microesferas). Com base em um artigo que descreve este modelo, a implementação foi tentada sem sucesso. Apesar deste modelo se encontrar amplamente estudado mais pesquisa é necessária para ajudar a construir um modelo robusto.

No summary/description provided

No summary/description provided

No summary/description provided

No summary/description provided

O cancro colorectal (CRC) é um dos tipos de cancro com maior prevalência a nível mundial, sendo responsável por um elevado número de mortes anualmente. O CRC resulta da acumulação de mutações genéticas e epigenéticas em células do trato gastrointestinal, nomeadamente em oncogenes e em genes supressores de tumor. Estas mutações acabam por resultar em alterações histológicas e morfológicas do colón, tais como o desenvolvimento de pólipos pré-cancerosos benignos que podem evoluir para neoplasmas e, subsequentemente, para carcinomas invasivos, caso não sejam tratados. Apesar de existirem formas da doença associadas a fatores hereditários, a esmagadora maioria dos casos de CRC são esporádicos e são resultado de mutações em células somáticas. O CRC pode ser curado em fases iniciais da doença, através da remoção cirúrgica do tumor e de quimioterapia. A radioterapia pode também ser útil para reduzir o risco de recorrência do tumor em alguns doentes. Contudo, muitos destes doentes já apresentam metástases na altura do primeiro diagnóstico, e muitos outros desenvolvem metástases ou recorrência local do tumor após remoção cirúrgica do mesmo. Formas metastáticas da doença são normalmente incuráveis e apresentam uma taxa de sobrevivência a 5 anos inferior a 10%. Assim, é necessário o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas capazes de tratar CRC metastático e de induzir remissões prolongadas desta doença. Uma vez que o cancro é uma doença multifatorial, na qual várias vias moleculares de sinalização estão envolvidas, nos últimos anos têm surgido várias abordagens combinatórias, que têm como alvo múltiplas destas vias de sinalização, com vista ao desenvolvimento de um tratamento mais eficaz para o CRC. A imunoterapia tem demonstrado um enorme potencial para tratar vários tipos de cancro, incluindo o CRC. Esta abordagem faz uso da capacidade do sistema imunitário de erradicar células tumorais, de forma eficaz e com melhor tolerância do que outras terapias mais convencionais, como é o caso da quimioterapia. As vacinas terapêuticas para o cancro constituem um exemplo de uma abordagem imunoterapêutica em desenvolvimento, as quais promovem a apresentação de antigénios específicos tumorais às células T, por células dendríticas (DC), resultando assim numa forte resposta imunológica assente na ação de células T ativadas contra as células tumorais. Apesar de promissoras, a sua aplicação clínica tem sido limitada, encontrando-se em estudo a sua associação com outros moduladores do microambiente tumoral de forma a aumentar a sua eficácia, bem como sensibilizar o microambiente tumoral para outras abordagens imunoterapêuticas, aumentando a resposta destes tumores agressivos, por exemplo, a modeladores da função de immune checkpoints. De facto, o microambiente tumoral é constituído por diferentes tipos de células, incluindo células do sistema imunitário, tais como linfócitos T e B, DC e macrófagos. As células tumorais possuem uma enorme influência nas células do microambiente tumoral, tornando-o altamente imunossupressor. Desta forma, as células do sistema imunológico que infiltram os tumores perdem as suas funções anti-tumorais e, em vez disso, promovem o crescimento e capacidade invasiva das células cancerígenas. Em especial, as células T regulatórias (Treg) e os macrófagos associados ao tumor (TAM) são abundantes no microambiente do CRC. As Treg são, em contexto fisiológico, essenciais para prevenir a autoimunidade. No entanto, no microambiente tumoral, estas células produzem moléculas imunossupressoras e inibem a produção de moléculas co-estimulatórias, resultando assim na supressão da maturação das DC e, consequentemente, na inibição da apresentação de antigénio e da resposta imunológica das células T. Os TAM também possuem um fenótipo imunossupressor dentro do microambiente tumoral, o que resulta na indução do desenvolvimento e crescimento tumoral. Para além disso, as células do microambiente tumoral produzem elevadas quantidades de TGF-β. Esta trata-se de uma citocina que apresenta um papel duplo no desenvolvimento e progressão do cancro. Por um lado, nas fases iniciais da tumorigénese, esta molécula regula a proliferação celular e a apoptose das células epiteliais do colón, apresentando um efeito anti-tumoral. No entanto, em fases mais avançadas da doença, existe uma sobrexpressão desta molécula no microambiente tumoral, em particular da isoforma TGF-β1. Durante a carcinogénese do CRC, esta isoforma induz a migração e a invasão das células tumorais, para além de contribuir para a supressão das células do sistema imunitário, através da promoção da infiltração de células Treg. Assim, tanto a presença de TAM como a produção de TGF-β1 no microambiente tumoral estão associadas a um prognóstico negativo para os pacientes de CRC. Esta tese apresenta uma nova abordagem para o tratamento do CRC, que envolve a combinação de uma nanovacina com a modulação do microambiente tumoral, nomeadamente a inibição da expressão de TGF-β1 e a inibição da função pró-tumorigénica dos TAM. Com esse objetivo, foram desenvolvidos dois tipos de nanopartículas (NP) poliméricas, biodegradáveis, constituídas por uma matriz de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA), capazes de incorporar diferentes agentes terapêuticos e de fazer a entrega dos mesmos a diferentes células alvo. Foi desenvolvida assim uma nanovacina capaz de incorporar antigénios peptídicos expressos pelo CRC, os adjuvantes Poly(I:C) e CpG-ODN e moléculas de siRNA anti-TGF-β1 (siTGF-β1) que promovem a inibição desta citocina. Esta NP foi funcionalizada com manose, de modo a promover a sua interação específica com as DC, que expressam abundantemente o recetor CD206 (também chamado recetor da manose) na sua superfície. Para além disso, a mesma nanoplataforma foi modificada de modo a promover o transporte de siTGF-β1, bem como dos imunoadjuvantes CpG-ODN e Poly(I:C) para as células tumorais. Para tal, estas NP foram funcionalizadas com o tripéptido Arg-Gly-Asp (RGD), que apresenta uma alta afinidade com as integrinas αvβ3/αvβ5, cuja expressão é acentuada na superfície das células tumorais, bem como de células endoteliais associadas a tumores. As NP formuladas apresentaram um diâmetro hidrodinâmico próximo de 200 nm e um índice de polidispersão próximo dos 0.2. Verificou-se também que as nanovacinas foram altamente internalizadas por células apresentadoras de antigénio (APC), nomeadamente macrófagos e DC, in vivo. A internalização das nanovacinas por parte das DC resultou no aumento significativo da molécula co-estimuladora CD86, bem como do complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHCI), indicando que esta levou à maturação das DC. Um estudo in vivo realizado em murganhos com CRC permitiu estudar a eficácia da nanovacina terapêutica (com siTGF-β1 na sua composição), em combinação com a NP direcionada para o microambiente tumoral e ainda em combinação com o Pexidartinib, um inibidor dos TAM. Combinações duplas entre a nanovacina e o Pexidartinib, e triplas com (1) a nanovacina, a NP direcionada ao microambiente tumoral e o Pexidartinib ou (2) a nanovacina administrada por duas vias, subcutânea (s.c.) e intratumoral (i.t.) e o Pexidartinib, foram testadas. A administração da dupla combinação Nanovaccina_ siTGF-β1 + Pexidartinib apresentou resultados mais promissores que a administração individual da Nanovacina_siTGF-β1 e do Pexidartinib, bem como resultados similares às restantes combinações triplas. Embora não tenham sido observadas diferenças significativas entre os volumes e massas médios dos tumores de animais tratados com as combinações duplas e triplas, observaram-se diferenças ao nível das populações de células do sistema imunitário que infiltraram o tumor. A combinação dupla entre Nanovacina_siTGF-β1 + Pexidartinib resultou em valores médios de volume e massa tumoral semelhantes às restantes combinações. No entanto, esta combinação promoveu uma elevada infiltração de células imunológicas no tumor, nomeadamente células T CD8+, linfócitos T citotóxicos (CTL) e células T natural killer (NK T). Esta tese destaca a importância da nanotecnologia no desenvolvimento de novas terapias para o cancro, nomeadamente para o CRC. O desenvolvimento de uma nanoplataforma capaz de incorporar diferentes biomoléculas com propriedades terapêuticas e de interagir com diferentes células alvo é de extrema importância para aumentar a eficácia do tratamento e para reduzir efeitos secundários adversos. Em particular, destaca-se o desenvolvimento de uma nanovacina que, ao ser combinada com a modulação do microambiente tumoral, através da inibição da expressão de TGF-β1 e das células TAM, parece apresentar resultados promissores num modelo animal de CRC.

No summary/description provided

O cancro constitui um dos principais e maiores problemas de saúde, a nível mundial, e continua a ser urgente o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais seguras, mas também eficazes que permitam controlar os estados mais avançados desta doença. Apesar dos progressos feitos nos últimos anos, na prevenção, diagnóstico e tratamento, a sua incidência continua a aumentar, sendo uma das principais causas de mortalidade. De facto, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima-se que em 2030 se registem mais de 13 milhões de vítimas mortais. Em termos gerais, o cancro engloba um vasto conjunto de doenças caracterizado por uma proliferação celular anormal e descontrolada. No caso de ser um tumor maligno, este pode desenvolver a capacidade de invadir e danificar os tecidos e órgãos adjacentes, por via linfática, num processo denominado por metastização. De todos os cancros humanos, o cancro da pele é um dos mais frequentes, e apesar de constituir uma pequena fração das neoplasias cutâneas, o melanoma representa o tipo de cancro da pele mais agressivo e mortal. O melanoma maligno é um tumor consideravelmente heterogéneo que resulta da ação combinada de diversos fatores, incluindo genéticos, individuais, ambientais, entre outros, estando o seu prognóstico fortemente relacionado com o estado da doença quando diagnosticada. Para além da excisão cirúrgica, quando diagnosticado precocemente, outras opções terapêuticas incluem a quimioterapia (com os agentes Dacarbazina e Temozolomida) e radioterapia, no entanto nenhuma delas tem um potencial igualmente curativo e os resultados clínicos são limitados. O melanoma avançado, e na sua forma metastática, é altamente caraterizado pela resistência à maioria das terapias convencionais e a sua mortalidade aumenta por falta de outras opções eficazes de tratamento. Assim, as terapias têm vindo a evoluir a partir de estratégias relativamente inespecíficas, para abordagens mais direcionadas. A partir de 2011 doentes afetados pela forma disseminada desta doença passaram a poder usufruir de novos agentes terapêuticos direcionados para alvos específicos identificados como estando associados aos estados mais agressivos desta doença. Destacam-se a aprovação de inibidores de BRAF/MEK, e mais tarde, de moduladores de vias de sinalização associadas a immune checkpoints. A imunoterapia, em oncologia, tem como objetivo restaurar ou amplificar uma resposta imune anti-tumoral por parte do hospedeiro, através da activação de uma rede complexa de células, que inclui linfócitos CD8+ efectores e CD4+ auxiliares, linfócitos B, células natural killer (NK), células dendríticas (DC), entre outras, bem como a libertação de citocinas e mediadores inflamatórios por parte destas células efectoras. No entanto, o tumor tem a capacidade de utilizar mecanismos de supressão fisiológicos, para 9 escapar a uma resposta imunitária, e criar um microambiente tumoral que favorece a sua proliferação e crescimento. Entre outros, o aumento da expressão de moléculas de regulação da resposta imune, que inclui os recetores proteína 4 associada aos linfócitos T citotóxicos, CTLA- 4, e morte celular-programada 1, PD-1, como mecanismo de inibição da ativação dos linfócitos T, estão entre os mecanismos mais utilizados para bloquear a acitividade anti-tumoral do sistema imunitário. Desta forma, o desenvolvimento de terapias que inibam estas moléculas, conhecidas como “immune checkpoints”, afigura-se como promissor no combate a um crescente número de tumores. Mais especificamente, a aprovação de anticorpos monoclonais anti- PD-1/PD-L1, como o Pembrolizumab e Nivolumab, tem vindo a revolucionar as opções de tratamento para doentes com melanoma, tendo já demonstrado benefícios clínicos e aumento de respostas objetivas, quando comparados à quimioterapia tradicional. No entanto, o aparecimento de mecanismos de resistência primária ou adquirida, e a indução de efeitos adversos são alguns dos fatores que ainda limitam a sua utilização. Além disso, ainda que a combinação destes modeladores com outras abordagens terapêuticas tenha permitido melhorar alguns destes aspetos, apenas uma percentagem de doentes responde a estas terapêuticas combinadas, observando-se o desenvolvimento de resistências. Desta forma, torna-se urgente o desenvolvimento de alterativas imunoterapêuticas que permitam sensibilizar o microambiente tumoral de forma a que volte a ser susceptível à ação anti-tumoral destas abordagens atualmente tão clinicamente relevantes. Recentemente, a utilização de pequenas moléculas como inibidores de immune checkpoints tem vindo a receber maior atenção devido às vantagens que apresentam sobre os convencionais anticorpos monoclonais, nomeadamente: capacidade de atravessar várias barreiras fisiológicas e biológicas; maior permeabilidade celular e difusão no microambiente tumoral, especialmente no caso de tumores sólidos; melhoria no perfil farmacocinético e farmacodinâmico; diminuição dos efeitos adversos; menor custo de produção e possibilidade para administração oral, entre outras. Para além disto, o avanço na nanotecnologia e no desenvolvimento de nanoestruturas para “drug delivery” tem vindo a possibilitar a síntese de nanomateriais com diferentes características, dependendo da ação terapêutica pretendida, bem como das propriedades fisico-químicas das moléculas ativas que por eles serão transportadas. Assim, a incorporação destas pequenas moléculas imunomoduladoras, assim como antigénios tumorais e potenciadores de resposta imune, em nanopartículas (NP) biocompatíveis e biodegradáveis irá, não só, permitir uma entrega eficaz, segura, e não-tóxica, mas também, aumentar a sua acumulação específica no local de interesse. Para além disso, irá também permitir uma libertação controlada do composto10 melhorando ainda mais a já promissora abordagem da inibição de immune checkpoints com pequenas moléculas com actividade biológica. Para além disso, a capacidade de modificação das propriedades biofísicas (ex: tamanho, carga e morfologia) das NP permite obter nanoplataformas de entrega desenhadas tendo em vista a sua interação com os sistemas biológicos alvo, aumentando a eficácia desta abordagem terapêutica. Assim, o principal objectivo do trabalho aqui descrito foi desenvolver NP poliméricas de ácido poliláctico (PLA) capazes de incorporar uma pequena molécula anti-Ligando-1 do Recetor da Morte Celular Programada, PD-L1 e a avaliação do seu efeito em células imunes e tumorais. Para tal, o efeito da pequena molécula #56 anti PD-L1 livre ou incorporada nas NP na viabilidade celular foi avaliado em duas linhas celulares (células dendríticas JAWSII (ATCC® CRL-11904™), melanoma, B16F10 (ATCC® CRL-6475™)), que representam subpopulações que expressam níveis mais elevados de PD-L1 no microambiente tumoral altamente imunosupressor. Avaliou-se de igual forma o efeito desta pequena molécula, livre ou incorporada nas NP, na inibição do PD-L1 na linha celular de melanoma anteriormente referida. Sendo que a indução de uma resposta imunológica robusta com a estimulação de linfócitos T CD4+ e CD8+, depende também da apresentação eficaz de antigénios tumorais pelas DC, actualmente reconhecidas como entidades fundamentais na estimulação de uma resposta imune eficaz, foi preparada e caracterizada uma NP multivalente, tendo em vista o transporte de combinações da pequena molécula anti PD-L1, com péptidos antigénicos de melanoma (Melan-A/MART-1) e o imuno potenciador CpG, de forma a que o expectável efeito sinérgico resulte numa maior eficácia anti-tumoral. Os resultados aqui descritos demonstram que as NP desenvolvidas, utilizando os métodos de única ou dupla emulsão com evaporação de solvente, apresentaram as características ideais para os objectivos anteriormente descritos, com um diâmetro hidrodinâmico médio inferior a 200 nm, uma distribuição de tamanhos homogénea (PdI < 0.2) com carga superficial negativa inferior a -8 mV. Importa realçar também a estabilidade e reprodutibilidade das NP preparadas por ambos os métodos, em particular o de dupla emulsão, sendo os valores de desvio padrão, para qualquer uma das características físico químicas, mínimo. Para além disto, estas NP permitiram eficiências de encapsulação, EE (% (w/w), e capacidade de carga, LC (μg/mg), elevadas para qualquer uma das biomoléculas activas incorporadas. Foi possível confirmar, com o ensaio de toxicidade, que até à concentração 10 μM, tanto as células dendríticas como as tumorais, toleraram a biomolécula activa anti-PD-L1 na sua forma livre e quando incorporada em NP de PLA, o que confirmou a sua potencial utilização no tratamento de melanoma. Para concentrações mais elevadas, a incorporação da biomolécula activa 11 anti-PD-L1 foi claramente vantajosa, por ter um menor efeito na viabilidade celular. Para além disto, o facto de apresentarem maior toxicidade nas células tumorais pode constituir uma vantagem apesar do mecanismo associado não ter sido identificado. Apesar do potencial inibitório desta molécula anti-PD-L1 ser inferior ao do anticorpo monoclonal testado, esta abordagem terapêutica tem claras vantagens para a sua potencial aplicação in vivo, nomeadamente a nível da redução de efeitos secundários adversos, daí que tenha que ser feito um compromisso entre eficácia e segurança. Considerando o trabalho aqui reportado, é possível concluir que a optimização de NP poliméricas para o transporte de uma pequena molécula moduladora do checkpoint imunológico PD-L1, permitiu desenvolver uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento do melanoma, que futuramente, poderá ser usada como alternativa aos anticorpos monoclonais. Em particular, a incorporação de misturas da biomolécula activa anti-PD-L1, com antigénios tumorais e imunopotenciadores em NP poliméricas, representa uma abordagem promissora para potenciar uma resposta imunitária anti-tumoral mais robusta e eficaz, com indução de memória. Assim, a entrega simultânea de TAA e imunoadjuvantes da resposta imunitária diretamente às células apresentadoras de antigénios, as DC, com moléculas bioactivas contra mecanismos de supressão da resposta imune, poderá representar uma estratégia terapêutica inovadora, não só para o melanoma, mas para o cancro no geral.

A presente tese analisa a intervenção do arquiteto bolonhês Antônio José Landi (1713- 1791) na Igreja de Santo Alexandre em Belém do Pará (em 1756) a partir de uma abordagem micro-histórica e à luz da teoria da imagem contemporânea. Por mais que aplicada a um caso bastante específico, a tese empreende não somente uma investigação sobre o objeto estudado, mas uma revisão teórica-metodológica que consiga melhor lidar com os questionamentos transdisciplinares de uma História da Arte transcontemporânea, principalmente concernentes a objetos culturalmente híbridos. A tese investiga os registros historiográficos que se remetem à atribuição da autoria da intervenção a Landi, referindo-se a uma carta escrita em 1756 pelo padre jesuíta Francisco Wolf (1707-1767) que relata a atuação anual da Companhia de Jesus no Pará. Essa documentação, inédita, integralmente transcrita e traduzida para português no Elenco Documental da tese, é acompanhada por outros documentos que subsidiam documentalmente o argumento. Objetiva, finalmente, demonstrar de forma trans-disciplinar o movimento imagético de um acervo memorial landiano, operando matrizes de diferentes tradições na composição da intervenção na Igreja de Santo Alexandre.