Repositório RCAAP

Nanoparticulate systems have been widely investigated as delivery vectors for efficient drug delivery in different diseases. Nanostructured lipid carriers (NLC) are composed of both solid and liquid lipids (glyceryl dibehenate and diethylene glycol monoethyl ether) and have demonstrated enhanced biological compatibility and increased drug loading capability. Furthermore, the use of peptides, in particular cell-penetrating peptides, to functionalize nanoparticles and enhance cell membrane permeation was explored in this paper. In this paper, we described the synthesis of a new conjugated of tranylcypromine with MAP. In addition, taking into consideration our previous results, this study developed different NLCs loaded with three central nervous system (CNS) drugs (tacrine (TAC), rasagiline (RAS), and tranylcypromine (TCP)) functionalized with model amphipathic peptide (MAP) and evaluated their activity against cancer cells. Particle size analysis demonstrated NLC presented less than 200 nm and a polydispersity index less than 0.3. Moreover, in vitro results showed that conjugation of MAP with drugs led to a higher decrease in cell viability of a neuroblastoma cell line and Caco-2 cell line, more than MAP alone. Furthermore, NLC encapsulation contributed to higher cellular delivery and enhanced toxic activity at lower concentrations when compared with free or co-administration drug-MAP conjugate.

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive and common form of glioma. GBM, like many other tumors, expresses high levels of redox proteins, such as thioredoxin (Trx) and thioredoxin reductase (TrxR), allowing tumor cells to cope with high levels of reactive oxygen species (ROS) and resist chemotherapy and radiotherapy. Thus, tackling the activity of these enzymes is a strategy to reduce cell viability and proliferation and most importantly achieve tumor cell death. Mercury (Hg) compounds are among the most effective inhibitors of TrxR and Trx due to their high affinity for binding thiols and selenols. Moreover, organomercurials such as thimerosal, have a history of clinical use in humans. Thimerosal effectively crosses the blood–brain barrier (BBB), thus reaching effective concentrations for the treatment of GBM. Therefore, this study evaluated the effects of thimerosal (TmHg) and its metabolite ethylmercury (EtHg) over the mouse glioma cell line (GL261), namely, the inhibition of the thioredoxin system and the occurrence of oxidative cellular stress. The results showed that both TmHg and EtHg increased oxidative events and triggered cell death primarily by apoptosis, leading to a significant reduction in GL261 cell viability. Moreover, the cytotoxicity of TmHg and ETHg in GL261 was significantly higher when compared to temozolomide (TMZ). These results indicate that EtHg and TmHg have the potential to be used in GBM therapy since they strongly reduce the redox capability of tumor cells at exceedingly low exposure levels.

Mercury (Hg) is known for its neurotoxicity and is reported to activate microglia cells at low exposure levels. Since mercury decreases the activity of the glutathione and thioredoxin systems, we hypothesize that Hg would, in turn, disrupt microglia homeostasis by interfering with redox regulation of signaling pathways. Thus, in this work, we analyzed the effect of exposure to Hg2+ on nuclear translocation and activation of NF-kB (p50) and p38 and pro-inflammatory gene transcription (IL-1ß; iNOS, TNF-alpha) considering the interaction of Hg with the glutathione system and thioredoxin systems in microglial cells. N9 (mouse) microglia cells were exposed to different concentrations of Hg2+ and the 24 h EC50 for a reduction in viability was 42.1 ± 3.7 μM. Subsequent experiments showed that at sub-cytotoxic levels of Hg2+, there was a general increase in ROS (≈40%) accompanied by a significant depletion (60–90%) of glutathione (GSH) and thioredoxin reductase (TrxR) activity. Upon 6 h of exposure to Hg2+, p38 (but not p50) accumulated in the nucleus (50% higher than in control), which was accompanied by an increase in its phosphorylation. Transcript levels of both IL1-ß and iNOS were increased over two-fold relative to the control. Furthermore, pre-exposure of cells to the p38 inhibitor SB 239063 hindered the activation of cytokine transcription by Hg2+. These results show that disruption of redox systems by Hg2+ prompts the activation of p38 leading to transcription of pro-inflammatory genes in microglia cells. Treatment of N9 cells with NAC or sodium selenite—which caused an increase in basal GSH and TrxR levels, respectively, prevented the activation of p38 and the transcription of pro-inflammatory cytokines. This result demonstrates the importance of an adequate nutritional status to minimize the toxicity resulting from Hg exposure in human populations at risk.

A presente dissertação tem como objetivo o estudo da instituição de ensino designada por Colégio dos Nobres da Cidade de Lisboa. Deste modo, serão apresentadas as linhas mestras da monarquia joanina, em particular, nas suas vertentes culturais e políticas, procurando depois, abordar o período de transição para a monarquia josefina, que contextualiza a institucionalização do colégio. O Colégio dos Nobres, surge, então, no seguimento de alguns acontecimentos que marcaram o ano de 1759. A reconfiguração social, que se evidencia após a execução dos Távora, a expulsão dos Jesuítas e a nomeação de D. Tomás de Almeida para ocupar o cargo de Diretor Geral dos Estudos, evidenciam uma nova conceção de sociedade, educação e poder. A partir do estudo das fontes primárias, dada a escassez bibliográfica, procuraremos definir, concretamente, o que se pode entender como Colégio dos Nobres, a quem era destinado, quem eram os seus alunos, quem era responsável pela sua gestão quotidiana, assim como dar a conhecer os professores que aí lecionavam, e também o que era lecionado. Destacando uma primeira premissa, deve considerar-se a fundação desta instituição como um processo, político, teórico e diplomático, visto que várias datas poderiam ser apresentadas, desde a nomeação de D. Tomás de Almeida, a publicação dos estatutos do colégio e a sua inauguração. Deste ponto de vista, será mais adequado encarar este estudo de um ponto de vista processual, evitando análises conducentes a datas estanques. Por fim, compreendendo a relação desta instituição de ensino com a Universidade de Coimbra e o futuro serviço do reino, será feita uma análise prosopográfica de alguns alunos, de modo a compreender se estes propósitos, que justificam a existência desta escola, se cumpriram.

Os modelos in vivo de isquemia cerebral fornecem-nos informações importantes sobre os processos bioquímicos envolvidos nos AVCs, assim como, desempenham um papel fundamental no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. O modelo de isquemia da artéria cerebral média (ACM) é um dos modelos in vivo amplamente utilizado em estudos experimentais, sendo o adequado para mimetizar a isquemia cerebral, uma vez que é um método robusto, não invasivo e reversível. Esta dissertação tem como objetivo sistematizar os vários métodos de validação do modelo animal de isquemia da ACM para haver uma maior reprodutibilidade em estudos futuros. Para a elaboração desta dissertação foi realizada uma pesquisa na base de dados Medline até março de 2021 para a recolha de todos os artigos. Foi então construída uma expressão de pesquisa recorrendo aos termos MeSH. Foram escolhidos os critérios de inclusão e exclusão, para seleção dos artigos a integrar nesta revisão sistemática da literatura. Subsequentemente, as características do rato, características de indução, anestesia, volume de enfarte e parâmetros estudados foram recolhidos de cada artigo por dois revisores e, quando necessário, com a ajuda de um moderador. Quanto às características dos ratos, as espécies mais utilizadas são os Sprague-Dawley ou Wistar adultos. A anestesia mais adequada para realizar a isquemia da ACM é o isoflurano e os períodos de isquemia variam de 1-2h e reperfusão de 24h a 72h. Foi também averiguado que o modelo de isquemia da ACM induz volumes de enfarte de 40-50%. Os parâmetros avaliados incluíram o comportamento (funções neurológicas, função sensoriomotora e testes cognitivos), testes histológicos (volume de enfarte, edema cerebral, GFAP, Iba1 e NeuN) e marcadores bioquímicos, tais como fatores inflamatórios (iNOS, COX-2, NF-κB, TNF-α, e interleucinas). Com os resultados obtidos neste estudo, será possível realizar estudos mais precisos e reprodutíveis na área da isquemia cerebral.

O cancro colorectal (CCR) é o segundo cancro mais mortífero em ambos os géneros, mundialmente, e o terceiro mais diagnosticado em homens e o segundo em mulheres. O CCR apresenta grande heterogeneidade em termos morfológicos, fenotípicos e funcionais, devido a um elevado número de alterações genéticas. É de conhecimento geral que o cancro é composto por uma mistura de células com capacidades autorregenerativas (células estaminais cancerígenas, CECs) e outras células com capacidades proliferativas, evidenciando um ciclo celular limitado (células não-regenerativas). As CECs consistem numa população de células cancerígenas no interior de tumores, apresentando várias características como autorregeneração e geração de células diferenciadas, contribuindo para a heterogeneidade tumoral. Adicionalmente, estas células são capazes de iniciar o crescimento tumoral, sendo responsáveis pela tumorigénese, além de exibirem mecanismos de resistência, cujos lhes conferem vantagem em termos de sobrevivência contra várias terapias, como a quimioterapia e a radioterapia, causando recaídas após tratamento. Tem sido, também, descrito que as CECs são capazes de formar tumores na presença de um sistema imunitário funcional, devido aos mecanismos de edição do sistema imune, como por exemplo, a baixa regulação da apresentação de antigénios, (através do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I – MHC-I) de modo a evitar a sua deteção por parte das células imunitárias. Com isto em consideração, é sugerido que a população de células sem MHC-I na sua superfície esteja enriquecida com CECs, as quais desenvolvem propriedades de quimioresistência contra terapias convencionais para o CCR, durante numerosas alterações genéticas e epigenéticas. Desta forma, utilizando como modelo o CCR, este projeto propõe-se a 1) realizar uma vasta caracterização da população de células cancerígenas negativas para o MHC-I, correlacionando com os atuais biomarcadores de CECs (CD44, Lgr5, EpCAM e o CD133); 2) testar a resposta de tratamento das células cancerígenas negativas para o MHC-I contra agentes quimioterapêuticos usados no CCR, tentando compreender se esta população exibe a propriedade de quimioresistência das CECs. Os resultados obtidos demonstraram que as células sem MHC-I na superfície não apresentam, homogeneamente, elevada expressão dos marcadores de CECs (CD44, Lgr5, EpCAM e CD133). Além disso, nos ensaios de quimiosensibilidade in vitro, não há consistência nos resultados relativos à população que será mais quimioresistente. Com isto, o MHC-I parece ser um biomarcador que sofre regulação mediante condições externas, numa tentativa de as células malignas adquirirem resistência ao longo de uma evolução tumoral, de modo a sobreviverem contra a ambientes adversos. Desta forma, a célula estaminal cancerígena talvez seja um estado transiente de uma célula cancerígena que sobreviveu a condições desfavoráveis.

O crescimento da população geriátrica mundial, com elevada incidência na Europa, cria um sentido de responsabilidade na participação dos doentes geriátricos no desenvolvimento de medicamentos, considerando que os dados obtidos em estudos com adultos mais jovens não podem ser directamente extrapolados para os idosos. Nesta dissertação, é apresentada uma explicação detalhada sobre o envelhecimento e as doenças relacionadas com a idade de forma a permitir caracterizar o doente geriátrico e, posteriormente, fazer a ligação com os requisitos necessários a um eficaz desenvolvimento de medicamentos centrado no paciente geriátrico. A legislação que, actualmente, suporta a aprovação de medicamentos para comercialização e a execução de ensaios clínicos, assim como a interacção entre o ambiente dos ensaios clínicos e o sujeito geriátrico são objecto de uma análise profunda. É proposto um conjunto de medidas regulamentares para a melhoria do desenvolvimento de medicamentos geriátricos baseado em evidências.

De acordo com a Comissão Europeia, Doenças Órfãs, ou Doenças Raras, são doenças que afetam menos do que 1 em cada 2000 indivíduos, ou seja, são patologias que apresentam uma baixa prevalência na população. A maioria das Doenças Órfãs são doenças genéticas e devido ao seu caracter “raro” o conhecimento sobre as mesmas é escasso, assim como a disponibilidade de medicamentos para o seu tratamento. As Doenças Hereditárias do Metabolismo (DHM) constituem um grupo especial de Doenças Órfãs genéticas, causadas por mutações em genes que codificam para enzimas ou transportadores envolvidos no metabolismo intermediário. Estas condições impossibilitam o bom funcionamento da via metabólica subjacente à enzima afetada, alterando toda a homeostasia celular. A maioria das DHM tem uma apresentação clínica severa, frequentemente com consequências motoras e neurológicas graves. Para a maioria destas doenças as terapias disponíveis envolvem a manipulação da dieta (terapia dietética) ou utilização de fármacos como terapia de suporte com o objetivo de aliviar os sintomas laterais da doença, no entanto, estas abordagens não têm demonstrado resultados significativos. A maioria das alterações nucleotídicas causadoras de DHM são mutações do tipo missense (≈85%) que dão origem a proteínas completas (full-length) com substituição de apenas um aminoácido o que frequentemente condiciona a aquisição da conformação correta (misfolding) da proteína expressa. O misfolding proteico pode afetar apenas a catálise e regulação enzimática, no entanto pode também afetar os seus níveis intracelulares, uma vez que estas proteínas misfolded são reconhecidas pelos sistemas de controlo de qualidade proteica intracelular e são encaminhadas para degradação. Devido a este mecanismo as DHM são muitas vezes denominadas como doenças conformacionais por perda-de-função (loss-of function). De forma a tentar corrigir estes erros no folding proteico, tem sido desenvolvida uma nova ferramenta molecular que assenta na utilização de pequenas moléculas que interagem com as proteínas misfolded promovendo a sua estabilização estrutural e, consequentemente, melhor funcionamento, sem nunca fazer parte da sua estrutura proteica final. Estas moléculas são designadas de chaperones farmacológicos. Recentemente, surgiu uma nova classe de moléculas designada por chaperones de atividade, cujo método de ação se centra na estabilização a proteína através da promoção da sua atividade. Neste trabalho foram estudadas três enzimas, envolvidas nas DHMs, e classificadas como Doenças conformacionais por perda-de-função. A primeira enzima abordada será a galactose-1-fosfato-uridil transferase humana (hGALT). A hGALT é uma proteína homodimérica que contem um átomo de Zn2+, e que se encontra envolvida no metabolismo da galactose (via de Leloir) onde a -D-galactose é convertida em glucose-1-fosfato. Nesta via, a hGALT converte uma molécula de difosfato de uridina glucose (UDP-glucose) e galactose-1-fosfato em difosfato de uridina galactose (UDP-galactose) e glucose-1-fosfato, através da remoção de uma molécula de monofosfato de uridina (UMP) da UDP-glucose. No caso de ocorrerem alterações na via de Leloir devido a uma deficiente atividade da hGALT por mutações no gene que a codifica, a DHM é classificada como Galactosémia Clássica, ou Galactosémia do tipo I. Os doentes com Galactosémia Clássica desenvolvem os primeiros sintomas na primeira semana de vida normalmente após ingestão de leite (alimento rico em galactose). Assim, a terapia usada, até à data, para o tratamento desta doença baseia-se sobretudo na remoção de todos os alimentos que contenham este açúcar, o que representa um enorme desafio para os doentes. Apesar desta terapia dietética contribuir para a prevenção de alguns sintomas mais graves, continua a não ser suficiente para evitar complicações a longo prazo com consequências graves a nível cognitivo e motor. A segunda e terceira enzimas abordadas neste trabalho são a isoforma 1 da tirosina hidroxilase humana (hTH1) e a isoforma 2 da triptofano hidroxilase humana (hTPH2). Estas duas enzimas em conjunto com a fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) constituem a família das hidroxilases dos aminoácidos aromáticos (AAAH). Estas enzimas são homotetraméricas, utilizam como cofator a tetrahidrobiopterina (BH4) e apresentam um átomo de Fe2+ no seu centro ativo, o qual se encontra envolvido na catálise. As AAAH estão envolvidas na síntese e metabolismo de catecolaminas e serotonina, através da hidroxilação dos aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano. As catecolaminas e a serotonina inserem-se no grupo das monoaminas, cuja função assenta na neurotransmissão e neuromodulação, sendo, portanto, agentes principais na regulação de processos como a diferenciação neuronal, termorregulação, sono, homeostasia e comportamento. A hTH1 é a enzima responsável pela conversão de L-tirosina em levodopa a qual é posteriormente descarboxilada e convertida em dopamina. Em caso de uma deficiente atividade da hTH1 por mutações no gene que a codifica estamos perante uma doença neurometabólica rara denominada Síndrome de Segawa ou Deficiência de Tirosina Hidroxilase. Os doentes com esta DHM podem desenvolver dois tipos de fenótipos (A ou B) com sintomas neurológicos e motores graves que se manifestam entre os primeiros 3 – 12 meses de vida. Nesta síndrome, as terapias adotadas têm-se baseado na administração de precursores dos neurotransmissores deficitários (como a levodopa), para a atenuação de sintomas. No entanto, esta terapia também se tem demonstrado insuficiente. Por último, a hTPH2 é a enzima responsável pela conversão de L-triptofano em 5-hidroxitriptofano que, posteriormente é descarboxilado e convertido em serotonina. Patologias como o transtorno obsessivo-compulsivo, depressão, défice de atenção e hiperatividade, atos suicidas ou outro tipo de transtorno psiquiátrico, estão associados a níveis baixos de serotonina ou de outros metabolitos derivados da serotonina. Desta forma, níveis diminuídos de hTPH2 estão associados a este tipo de patologia. Apesar de já se conhecerem mutações patogénicas no gene que codifica para esta enzima, ainda existem poucas informações estruturais e funcionais sobre a hTPH2. No entanto, como esta enzima se insere na família das AAAH, conjuntamente com a hPAH e a hTH1, e uma vez que as estruturas e mecanismos de ação destas enzimas já são conhecidos e apresentam um elevado grau de similaridade, prevê-se que a hTPH2 terá um comportamento semelhante. Uma vez que as deficiências de hGALT, hTH1 e hTPH2 são classificadas como Doenças conformacionais e que para estas DHM não se encontram disponíveis terapias farmacológicas, neste trabalho estudaram-se três moléculas (composto 2, composto 14, e composto 17) de baixa massa molecular, derivados de 3-hidroxiquinolin-2-onas (3HQ), pelo seu potencial efeito sobre a hGALT, hTH1 e hTPH2 como chaperones farmacológicos ou chaperones de atividade. Estes compostos foram selecionados uma vez que o seu núcleo estrutural (3-hidroxi-quinolinina) tem a capacidade de complexar iões metálicos (ex: Fe2+ e Zn2+), os quais se encontram na estrutura das proteínas em estudo - hGALT (Zn2+), hTH1 (Fe2+) e hTPH2 (Fe2+). Os compostos testados foram produzidos pelo grupo de Química BioOrgânica do Instituto de Investigação do Medicamento da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa (iMed-ULisboa) e foram desenhados inicialmente com o intuito de interagirem com o centro ativo da hPAH. Tendo em conta a semelhança estrutural e funcional da família das AAAHs e o facto da hGALT apresentar Zn2+ na sua estrutura, testámos o efeito destes compostos na modulação da estabilidade e atividade da hGALT, hTH1 e hTPH2. Para este efeito foi necessário primeiro proceder à otimização do método de expressão e purificação da hGALT, hTH1 e hTPH2 de modo a obter proteínas recombinantes com um elevado grau de pureza e em níveis elevados. As proteínas recombinantes foram produzidas em células de E.coli BL21(DE3) e purificadas por cromatografia de afinidade com iões imobilizados. De seguida, verificámos o perfil oligomérico das proteínas purificadas através de uma cromatografia de exclusão molecular. Após a verificação do perfil da proteína purificada, procedemos aos ensaios de estabilidade e de atividade. O perfil de estabilidade térmica foi obtido por fluorimetria diferencial de varrimento, extraindo os valores de temperatura de melting das proteínas na ausência e presença dos compostos. Utilizando métodos de HPLC (High Performance Liquid Chromatography), otimizados neste trabalho para quantificação de produto formado por unidade de tempo e quantidade de proteína, foi possível determinar a atividade enzimática da hGALT, hTH1 e hTPH2 na ausência e presença dos compostos. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que, em relação à estabilização estrutural das proteínas, na generalidade estes compostos não causaram uma diferença significativa na estabilização ou destabilização das mesmas, uma vez que não se verificou uma variação igual ou superior a 2 ºC na temperatura de melting. Apenas o composto 2 teve um efeito significativo na temperatura de melting da hGALT, provocando uma diminuição de 3.4 ºC na mesma, o que indica uma destabilização da estrutura da proteína. Desta forma, não foi possível determinar para estes compostos um possível efeito terapêutico como chaperones farmacológicos para a hGALT, hTH1 e hTPH2. Em relação à atividade enzimática, verificou-se que todos os compostos incrementam a atividade enzimática da hTH1 e hTPH2, embora com respostas diferentes para cada uma das enzimas testadas. Para a hTH1 a resposta obtida foi de composto 17 > composto 2 > composto 14 (+102 > +61 > +12%, respetivamente), enquanto para a hTPH2 foi de composto 17 > composto 14 > composto 2 (+33 > +21 > +5%, respetivamente). No caso da hGALT não foi possível observar um aumento de atividade residual com os compostos 17 (+2%) e 14 (+1%), sendo que o composto 2 conduziu a uma perda de atividade de cerca de 20%. A ausência de efeito sobre a hGALT poderá indicar que estes compostos poderão apresentar um efeito específico sobre enzimas contendo Fe não-hemíco na sua estrutura. Poderá também indicar que para os compostos exercerem o seu efeito o ião metálico alvo terá que se encontrar no centro ativo, ou mais próximo deste. Perante estes resultados, considerou-se que as 3HQ estudadas apresentam um potencial efeito de chaperone de atividade em relação à hTH1 e hTPH2. Apesar dos ensaios realizados não terem sido suficientes para afirmar se os compostos testados funcionam efetivamente como chaperones de atividade ou farmacológicos, forneceram dados preliminares que permitiram avaliar o seu potencial efeito nas proteínas estudadas. Serão necessários estudos adicionais detalhados que permitam proceder a uma caracterização bioquímica e biofísica das proteínas na ausência e presença destas moléculas. Uma vez que o grupo de Metabolismo e Genética já validou a metodologia para o estudo do efeito destes derivados sobre a hPAH, é possível agora aplicar esses ensaios às enzimas estudadas neste trabalho uma vez que as metodologias para produção, purificação e determinação da atividade enzimática foram desenvolvidas na tese apresentada.

Os ácidos gordos são uma importante fonte de energia para o organismo e por isso a célula apresenta vias metabólicas específicas para a sua metabolização, nomeadamente através da via da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos (mFAO). Alterações na mFAO e na cadeia respiratória mitocondrial podem apresentar uma causa genética, sendo assim classificadas como doenças hereditárias do metabolismo. As alterações da mFAO podem causar doenças graves com variadas manifestações clínicas, principalmente relacionadas com o comprometimento metabólico do tecido músculo- esquelético e de órgãos como o fígado e coração. As doenças hereditárias da via da β-oxidação mitocondrial dos ácidos gordos são doenças autossómicas recessivas que incluem cerca de 20 doenças diferentes, e que afetam esta via nos seus diferentes passos, desde o transporte de ácidos gordos no citoplasma até à sua β-oxidação mitocondrial final. Os doentes com alterações hereditárias da mFAO geralmente apresentam intolerância ao jejum. A doença pode ser fatal, uma vez que os ácidos gordos são nutrientes importantes que ajudam o organismo a suportar longos períodos de jejum, fornecendo energia quando a glicose não está disponível e o glicogénio se esgota. Este aspeto é particularmente relevante para o tecido cardíaco uma vez que o coração depende principalmente da mFAO para produção de energia sendo que a privação desta fonte de energia contribui para o desenvolvimento de cardiomiopatia metabólica. Cada ciclo da β-oxidação envolve quatro reações químicas diferentes, exigindo assim quatro tipos diferentes de enzimas. O primeiro passo do ciclo é responsável pela desidrogenação dos acil-CoAs a qual é promovida pela família das acil-CoA desidrogenases (ACADs) e que engloba as desidrogenases de acil-CoAs de cadeia curta (SCAD), cadeia média (MCAD) e cadeia muito longa (VLCAD). Estas enzimas apresentam uma especificidade para o número de átomos de carbono da cadeia hidrocarbonada, sendo que a MCAD é ativa para os acil-CoAs de cadeia média (C6 a C12). A deficiência em desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCADD), foi identificada pela primeira vez em 1976, e constitui a doença hereditária mais comum da mFAO. A MCADD é causada por mutações no gene ACADM, localizado no cromossoma 1p31, constituído por 12 exões e com 44.2 kb. Esta deficiência é mais comum na população Caucasiana do noroeste da Europa. Os doentes com MCADD apresentam níveis elevados de acilcarnitinas de cadeia média (C6 a C10), particularmente octanoil carnitina (C8) pela dificuldade em catabolizar os ácidos gordos de cadeia média. A acumulação de derivados da carnitina pode comprometer a homeostasia mitocondrial, havendo evidências de que alteram o metabolismo energético por inibição do transporte de eletrões na cadeia respiratória (complexos I-III, II-III e IV), da creatina cinase mitocondrial e Na+, K+ e ATPase sináptica no cérebro. A MCAD tem um papel importante no metabolismo energético não só porque contribui para a pool de acetil-CoA que alimenta o ciclo de Krebs mas também porque no processo de desidrogenação dos acil-CoAs há formação de FADH2 o qual transfere os seus eletrões indiretamente à cadeia respiratória. Neste processo é fundamental o papel da flavo-proteína de transferência de eletrões (ETF). Esta proteína aceita eletrões de um conjunto diferente de flavo- enzimas envolvidas em várias vias mitocondriais não só na β-oxidação de ácidos gordos, mas também na degradação de aminoácidos. De facto, a ETF é uma proteína aceitadora, de pelo menos 9 desidrogenases diferentes, transferindo os equivalentes redutores obtidos nas reações de desidrogenação para a ETF-ubiquinona oxidorredutase (ETF-QO), que por sua vez fornece os equivalentes redutores à cadeia respiratória. Assim, numa situação normal a MCAD deverá interagir com a ETF, de modo a fazer a passagem de eletrões para a cadeia respiratória. Os doentes com MCADD podem apresentar crises metabólicas recorrentes e que incluem hipoglicémia hipocetótica com letargia, devido ao esgotamento das reservas de glicogénio. Esta patologia apresenta uma alta taxa de mortalidade, especialmente na infância. No entanto, os doentes podem ser assintomáticos até a primeira crise metabólica, que pode ocorrer apenas na idade adulta. A MCADD é uma das doenças hereditárias do metabolismo diagnosticada nos programas de rastreio neonatal (NBS) em vários países, incluindo Portugal. O diagnóstico é efetuado pela quantificação de acilcarnitinas, em amostras de sangue colhidas no calcanhar dos recém- nascidos (“teste do pezinho”), por espectrometria de massa em tandem (MS/MS). Atualmente o único tratamento consiste em evitar longos períodos de jejum e nalguns casos uma suplementação em carnitina para aumentar a desintoxicação dos metabolitos de ácidos gordos acumulados no organismo. Por essa razão, é crucial desenvolver terapias farmacológicas. Uma vez que a MCADD é presentemente classificada como uma doença conformacional por perda-de-função, a utilização de pequenas moléculas capazes de estabilizar as variantes de MCAD conformacionalmente alteradas (misfolded), atuando como chaperones farmacológicos, seria uma opção terapêutica viável. Contudo, para identificar e desenvolver tais moléculas, o mecanismo molecular patogénico das variantes de hMCAD deve ser primeiro identificado, caracterizado e entendido. Nesta perspetiva, este trabalho teve como objetivo compreender os mecanismos moleculares patogénicos de 12 variantes de hMCAD causadas por mutações missense no gene ACADM. Para atingir este objetivo as 12 variantes hMCAD e a forma selvagem (WT), foram produzidas num sistema de expressão procariota e posteriormente purificadas por cromatografia de afinidade com iões imobilizados (IMAC) sendo as formas homotetraméricas biologicamente ativas futuramente isoladas por cromatografia de exclusão molecular. As proteínas recombinantes obtidas foram caracterizadas a nível funcional e estrutural. A caracterização funcional incluiu não só a determinação da atividade enzimática, recorrendo ao par redox artificial PMS/DCPIP (metassulfato de fenazina/ 2,6-diclorofenolindofenol) onde o PMS funciona como aceitador intermediário e o DCPIP o aceitador final; como também a determinação da atividade enzimática utilizando a molécula natural (ETF) como aceitador intermediário (ETF/DCPIP). Para efetuar este ensaio, neste trabalho procedeu-se também ao desenvolvimento e otimização da produção e purificação da proteína ETF. Foi assim possível compreender se as variantes proteicas em estudo interagiam funcionalmente com a ETF. Estudou-se também o perfil da inativação térmica enzimática das proteínas alvo, uma vez que os perfis de inativação térmica estão fortemente correlacionados com alterações de conformação da proteína (agregação, dissociação em subunidades e desnaturação). Para abordar a estabilidade estrutural/conformacional, realizaram-se vários ensaios e que incluíram a avaliação do perfil de oligomerização, uma vez que o misfolding proteico origina frequentemente alterações na sua estrutura quaternária provocando mudanças no equilíbrio das formas oligoméricas (tetrâmeros, dímeros e monómeros) contribuindo para uma maior tendência para a agregação e consequente perda de funcionalidade. Efetuaram-se ainda ensaios de proteólise limitada por tripsina para avaliar possíveis alterações da estrutura terciária. Para monitorizar a estabilidade térmica da conformação proteica utilizou-se a fluorimetria diferencial de varrimento (DSF), método que foi ainda utilizado para determinar a constante aparente de ligação do FAD. De modo a obter uma melhor compreensão a nível da reorganização espacial das substituições de aminoácidos e do impacto nas interações com o FAD, substrato e hETF realizaram-se ensaios in silico recorrendo ao software UCFS Chimera. No seu conjunto, os resultados obtidos suportam a hipótese de que nas variantes hMCAD estudadas as substituições de aminoácidos têm um forte impacto na conformação proteica resultando numa perda de função enzimática. Quer a nível estrutural, quer funcional as variantes que demonstram ser particularmente instáveis e propensas a alterações conformacionais acentuadas encontram-se distribuídas pelos três domínios proteicos e incluem as variantes p.Y48C e p.A140T no domínio N-terminal -helicoidal, a variante p.D143V no domínio central folha-β e a variante p.Y372N no domínio C-terminal α-helicoidal. Estas proteínas apresentam dificuldade na incorporação do FAD na sua estrutura, um elemento crucial para o seu folding mitocondrial, oligomerização adequada e atividade enzimática. Este poderá ser um dos fatores da sua instabilidade, quer a nível estrutural quer funcional. Em suma, todas as variantes hMCAD analisadas neste estudo, mostraram alterações a nível bioquímico e estrutural, embora com diferentes graus de gravidade que, em última análise, poderão conduzir a uma degradação precoce no contexto biológico. A recuperação da conformação proteica pode ser potencialmente conseguida através da utilização de chaperones farmacológicos, particularmente para as variantes que mostraram maior instabilidade estrutural.

A descoberta da existência de neurogénese, processo de produção de novos neurónios a partir de células estaminais neurais (NSCs), em zonas específicas no cérebro adulto, tem sido alvo de um grande interesse terapêutico. Curiosamente, tem sido descrito que uma via importante de comunicação celular inclui a libertação parácrina de moléculas, fatores solúveis e microvesículas, como os exossomas. As NSCs secretam uma vasta gama de moléculas, funcionando também como células-alvo do seu próprio secretoma. No entanto, a atividade das NSCs, incluindo a sua atividade parácrina, diminui com o envelhecimento e a neurodegenerescência, tornando-se urgente a descoberta de novas estratégias viáveis que compensem o declínio desta proteção endógena ao longo da vida. Curiosamente, o metabolismo tem sido reconhecido como um regulador chave da atividade e função das NSCs e evidências recentes sugerem que aquele possa, também, modular a composição do secretoma celular. No entanto, o papel do metabolismo na regulação do secretoma proveniente das NSCs adultas nunca foi explorado anteriormente. Neste trabalho pretendemos explorar o papel da reprogramação bioenergética na melhoria do perfil terapêutico do secretoma de NSCs em modelos in vitro de neurodegenerescência. Para avaliar os efeitos terapêuticos do secretoma utilizámos como células alvo NSCs expostas ao 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+) e ao peróxido de hidrogénio (H2O2), como forma de mimetizar os danos celulares associados às NSCs circundantes, quer em condições de proliferação, ou em condições de diferenciação. Começámos, inicialmente, por avaliar o efeito de alguns estimuladores mitocondriais na melhoria das propriedades terapêuticas do secretoma das NSCs. Curiosamente, os resultados demonstraram que a estimulação da atividade mitocondrial não melhora as propriedades protetoras do secretoma das NSCs, induzindo mesmo o efeito oposto. De seguida, avaliámos se a exposição direta a um estímulo tóxico poderia ter um impacto positivo no perfil parácrino das NSCs. No entanto, o estímulo tóxico apenas resultou na produção de um secretoma ainda mais prejudicial. Por fim, adicionámos às NSCs produtoras de secretoma um meio condicionado proveniente de células lesadas, contendo possivelmente mediadores inflamatórios e outros sinais de lesão capazes de provocar uma resposta protetora adaptativa das NSCs às células circundantes. Estas NSCs estimuladas foram designadas de boostedNSCs e o seu secretoma foi denominado de boostedCM. Curiosamente, os resultados mostraram que, embora o boostedCM não tenha sido capaz de proteger as NSCs da morte celular em condições de proliferação, reduziu significativamente a morte de NSCs em condições de diferenciação. Com o objetivo de explorar quais as alterações metabólicas associadas à melhoria do secretoma das NSCs (boostedCM), analisámos algumas características da dinâmica, biogénese e metabolismo mitocondrial das boostedNSCs. Verificámos que as boostedNSCs apresentavam um aumento da expressão de proteínas associadas à fissão mitocondrial, uma diminuição dos níveis de ATP e um aumento da razão NAD+/NADH. Por outro lado, os níveis de expressão de proteínas associados à biossíntese de lípidos, como a proteína de ligação a elementos reguladores de esteróis (SREBP-1) e a acetil-CoA carboxilase 1 (ACC1), revelaram-se também aumentados. Adicionalmente, verificámos um aumento dos níveis de expressão de proteínas antioxidantes, como a Sirtuin 3 (SIRT3) e a tioredoxina 1 (TRX1), podendo esta última ser secretada pelas células. Por fim, para perceber as alterações desencadeadas nas células alvo, foram também avaliados alguns aspetos metabólicos nas NSCs em condições de diferenciação, sob lesão neural. De facto, os resultados mostraram que o secretoma das boostedNSCs (boostedCM), para além de proteger a morte celular das células recetoras, induziu também um aumento dos níveis de ATP e NADH nessas células. Em suma, estes dados demonstram que as NSCs quando expostas a sinais de lesão externa apresentam profundas alterações metabólicas que resultam na produção de um secretoma protetor para as células circundantes mais diferenciadas. Por outro lado, a regulação do metabolismo das NSCs pode representar uma estratégia promissora para potenciar a inibição da neurodegenerescência em vários contextos de lesão neurológica.

A fenilcetonúria (PKU) é a doença genética rara que afeta com maior prevalência o metabolismo de aminoácidos. Esta doença é causada por mutações que afetam o gene PAH que codifica para a enzima fenilalanina hidroxilase humana (hPAH), expressa maioritariamente nos hepatócitos. Esta proteína é responsável pela conversão de fenilalanina (L-Phe) em tirosina (L-Tyr) na presença do cofator tetrahidrobiopterina (BH4), oxigénio molecular e de Fe(II) não hemíco presente no centro ativo. Atualmente, continua a haver urgência no desenvolvimento de novas terapias para a PKU, sendo que as frequentemente utilizadas envolvem uma restrição alimentar (terapia dietética) e a suplementação com o cofator BH4. A hPAH é um homotetrâmero em que cada subunidade (≈ 50 kDa) apresenta um domínio regulador N-terminal, um domínio catalítico e um domínio de oligomerização C-terminal responsável pela dimerização e consequente tetramerização. Uma terapia de reposição enzimática (ERT) envolvendo a administração de hPAH é presentemente um desafio devido em parte à instabilidade da proteína (elevada sensibilidade às condições do meio), à elevada massa molecular (≈200 kDa), necessidade da presença de tetrâmeros e do cofactoe enzimático exercer a sua função no ambiente biológico. Uma solução atrativa para ultrapassar estes constrangimentos envolve a formulação da proteína mantendo a sua estabilidade e funcionalidade e de um bom sistema de distribuição biofarmacológica, como os enzimossomas. Neste trabalho são apresentados os resultados obtidos na otimização das condições de modificação da hPAH para futuramente ligar covalentemente a enzima a lipossomas vazios produzindo enzimossomas. A hPAH recombinante foi expressa em E. coli e purificada através do recurso a uma cromatografia de afinidade com iões imobilizados. As espécies tetraméricas, posteriormente isoladas por cromatografia de exclusão molecular, foram modificadas usando diferentes razões de agente modificador:hPAH (8:1; 16:1 e 24:1), sendo utilizado como agente modificador o N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA). A hPAH modificada foi isolada e caracterizada em termos de rendimento de proteína recuperada, grau de modificação, atividade enzimática com pré-ativação por L-Phe, termoestabilidade e conformação quaternária. Através da comparação dos resultados obtidos com os da hPAH não-modificada, mas sujeita às mesmas condições reacionais da proteína modificada, observou-se alterações mínimas na atividade enzimática e um ligeiro aumento na termoestabilidade (parâmetro Tm) da proteína modificada. Estes dados indicam que a hPAH modificada preserva a sua função catalítica e estabilidade. Este trabalho permitiu assim estabelecer as condições experimentais para no futuro ligar covalentemente a proteína modificada a lipossomas vazios formando enzimosomas.

O presente trabalho intitulado “O património escultórico quinhentista no Convento de Cristo, em Tomar. Inventariação, catalogação e percursos expositivos”. É como o título indica um estudo do património escultórico existente no Convento de Cristo em Tomar, realizado durante o séc. XVI, que incide sobre as peças de suporte, em especial as colunas e os seus componentes, do mestre de obras João de Castilho. Este estudo levou à criação de um inventário vasto, de colunas, bases, capiteis, frisos, púlpitos, janelas, entre outros elementos. Posteriormente ainda levou à criação de um catálogo, também de relativa grande dimensão, onde se encontra um resumo de todos os elementos inventariados, tem um exemplo de cada tipo de peça encontrada em todos os espaços e divisões que se encaixavam no período histórico inicialmente definido. Por fim realizou-se uns percursos de visitas guiadas que passariam a dar destaque às zonas onde se encontra as peças que foram objeto de estudo.

As plantas halófitas são plantas que possuem a capacidade de crescer em zonas caracterizadas por concentrações salinas extremas e que, por consequência, possuem na sua composição um elevado teor em sal na forma de cloreto de sódio (NaCl). Estão já identificadas cerca de 5000 a 6000 espécies de plantas halófitas e a utilização destas plantas como possíveis ingredientes em alimentos tem-se revelado recentemente como uma área de investigação importante. Sendo o consumo de sódio um dos principais fatores a contribuir para a elevada incidência de hipertensão no mundo, é urgente procurar alternativas ao seu consumo e estas plantas constituem uma fonte de outros minerais que têm sido estudados como possíveis alternativas ao consumo de sódio. O potássio tem demonstrado atividade antihipertensiva e outros minerais como o cálcio e o magnésio podem ser interessantes na problemática da hipertensão. Paralelamente, estas plantas podem integrar, na sua composição, fitoquímicos que promovam uma diminuição da pressão arterial, como os ácidos fenólicos e flavonoides, que têm sido referidos como sendo compostos com atividade antihipertensiva. Assim, as plantas halófitas surgem como uma possível alternativa à utilização do sal convencional com a vantagem de contribuírem para a perceção do sabor salgado devido à presença de sódio, mas também de outros minerais, e possuírem ainda na sua composição compostos que são reconhecidos como tendo propriedades hipotensoras. Outras atividades biológicas como propriedades antibacteriana, antifúngica, hepatoprotetora, antioxidante, antitumoral, anti-inflamatória, e entre outras, têm sido também referidas na bibliografia. Esta dissertação teve como objetivo principal avaliar as potencialidades nutricionais e caracterizar quimicamente plantas halófitas produzidas em Portugal. A escolha das plantas a estudar teve como base uma recolha de informação junto de diferentes produtores a operar no território nacional. Assim, foram escolhidas quatro espécies: Crithmum maritimum, Inula crithmoides, Salicornia ramosissima (R1 e R2) e Sarcocornia fruticosa. No caso da Salicornia ramosissima, foram estudadas duas proveniências (designação “R1” e “R2”) que se caracterizavam por serem produzidas num ambiente natural (R1) e em hidroponia (planta R2). As restantes espécies estudadas cresceram em ambiente hidropónico. Numa primeira fase do trabalho foram determinados os parâmetros nutricionais, a composição mineral, o perfil fitoquímico e a atividade antioxidante e antihipertensiva das plantas halófitas selecionadas. Os resultados obtidos mostram que as cinco plantas halófitas selecionadas apresentaram uma percentagem de humidade superior a 85%. Estas plantas mostraram ser uma fonte interessante de proteína (valores superiores a 2,5 g/100g, exceção para a S. ramosissima (R1)), fibra (C. maritimum, I. crithmoides e S. fruticosa com valores superiores a 3,0 g/100g) e ácidos gordos polinsaturados (percentagens superiores a 50% do conteúdo de ácidos gordos total). Relativamente à composição mineral, esta variou entre as plantas halófitas estudadas, sendo que foram detetados valores mais elevados de sódio (22,50 ± 2,93 g/kg) e magnésio (1,09 ± 0,15 g/kg) na S. ramosissima (R1). Maiores teores de cálcio foram determinados na I. crithmoides (0,82 ± 0,10 g/kg). Teores mais elevados de potássio (3,50 ± 0,74 g/kg) foram doseados na S. fruticosa. No que se refere à presença de fitoquímicos, a S. ramosissima (R1) apresentou o teor mais elevado de compostos fenólicos totais (1,02 ± 0,04 mg GAE/g). Ácidos fenólicos como 3- e 5-cafeoilquínico, ácido p-cumárico e respetivos derivados, e flavonoides como a quercetina e seus derivados foram identificados nas quatro espécies de plantas halófitas estudadas. No que se refere à atividade biológica, foram avaliadas a atividade antioxidante (por ORAC e HOSC) e antihipertensiva (por ensaio inibitório de ACE). A S. ramosissima (R1) apresentou os melhores resultados de atividade antioxidante para os testes de ORAC e HOSC (23,8 ± 3,1 e 26,1 ± 2,3 μmol TEAC/g, respetivamente). No que se refere à atividade antihipertensiva, as plantas halófitas S. fruticosa e S. ramosissima (R1 e R2) apresentaram IC50s idênticos (93,0 ± 7,9, 95,6 ± 14,1 e 102,3 ± 14,4 mg/ml, respetivamente). Numa segunda fase do trabalho, selecionou-se uma das plantas, S. ramosissima (R1), que foi submetida a dois processos de secagem (secagem em forno convencional a 70 ºC durante 3 dias e liofilização) e os resultados obtidos no que se refere à sua composição química foram comparados. A seleção da planta halófita teve como base o facto de apresentar teor mais elevado de TPC, atividade antioxidante bem como de atividade antihipertensiva. Os resultados mostraram que os extratos etanólicos obtidos a partir da planta liofilizada apresentavam teores estatisticamente superiores de compostos fenólicos, 9,74 ± 0,88 mg GAE/g vs. 7,41 ± 0,29 mg GAE/g doseados na amostra sujeita a secagem convencional. No que se refere à atividade antioxidante, os resultados mostraram a mesma tendência, 418,8 ± 54,0 vs. 291,1 ± 17,9 μmol TEAC/g valores obtidos para o método de ORAC e 237,2 ± 12.0 vs. 147,2 ± 12,4 μmol TEAC/g para o método HOSC, respetivamente para a planta liofilizada vs. planta sujeita a secagem convencional. A atividade antihipertensiva no ensaio inibitório de ACE para a S. ramosissima seca e liofilizada foi estatisticamente idêntico (24,6 ± 1,7 e 18,9 ± 0,6 mg/g, respetivamente). Foram ainda comparados os teores em quercetina-ramnosil-hexósido, quercetina-malonil-hexósido e 3,5-dicafeoilquínico que se revelaram superiores nos extratos da planta halófita liofilizada (88,04 ± 2,59, 4281,0 ± 24,1 e 480,6 ± 15,6 μg/g, respetivamente, vs. 52,90 ± 1,34, 1578 ± 30 e 223,4 ± 9,3 μg/g, respetivamente, na planta seca). No que se refere à composição volátil, os resultados mostram que a planta S. ramosissima fresca e liofilizada apresentam teores superiores, expressos em áreas relativas, para compostos que são descritos como tendo odores a fresco e verde, tais como (E)-3-hexen-1-ol, 1-hexanol, p-cimeno, 1,8-cineole, β-tujone, e outros. A análise da planta halófita seca a 70 ºC permite detetar, numa percentagem de área relativa superior, compostos que são descritos como tendo odores menos agradáveis tais como heptanal, 1-octen-3-ol e ácido metilbutanoico, apesar da percentagem de área relativa elevada de hexanal, composto descrito com odores que remetem para o verde e ervas. Apesar do método de secagem por liofilização apresentar vantagens no que se refere às determinações efetuadas, foi selecionada a S. ramosissima seca a 70 ºC para se desenvolver produtos que foram sujeitos a avaliação sensorial por consumidores. A escolha foi feita com base na facilidade de implementação a nível industrial do processo de secagem convencional em comparação com a liofilização, tendo em conta que este último processo apresenta custos mais elevados e é de maior complexidade. Numa fase final do trabalho, a planta halófita S. ramosissima fresca e seca foi utilizada, em primeiro lugar, como ingrediente na preparação de pipocas doces e salgadas. Foram preparadas duas amostras distintas, onde a S. ramosissima fresca e seca foram usadas como substituintes do sal convencional nas amostras. Foi pedido a um painel de consumidores (n = 31) que avaliasse as duas amostras em termos de sabor e aparência. Os resultados demonstraram que, tanto em termos de aparência como de sabor, os consumidores preferiram a amostra de pipocas doces e salgadas com incorporação de S. ramosissima seca. A cor verde intensa na amostra com S. ramosissima fresca não foi considerada agradável para grande parte dos consumidores. Este resultado foi confirmado num segundo teste realizado com um número superior de provadores (n = 219). Estes resultados serão de valorizar tendo em vista o desenvolvimento de novos produtos com plantas halófitas. Foram ainda desenvolvidos dois molhos ketchup em que se procedeu à adição de S. ramosissima seca em duas percentagens diferentes (2,2 e 3,0%). Foi realizada uma prova sensorial em que os consumidores (n = 102) avaliaram as amostras em termos de aparência, aroma e sabor. Para todos os atributos, houve uma preferência para a amostra com menor percentagem de S. ramosissima. Em suma, este trabalho permitiu caracterizar plantas halófitas produzidas em Portugal e proceder a uma avaliação preliminar da possibilidade da sua introdução como ingrediente em alternativa ao uso de sal convencional. Dados os resultados positivos obtidos na avaliação sensorial, será importante no futuro perceber realmente a eficácia das halófitas como ingrediente funcional como uma estratégia de diminuir a incidência de hipertensão na população.

A investigação clínica pode ser definida como qualquer proposta relacionada com sujeitos humanos, incluindo voluntários saudáveis, que envolva intervenção ou observação física ou psicológica, ou recolha, armazenamento e disseminação de informação clínica. É uma atividade muito regulamentada, com grande importância social e económica para o país, e que engloba diversos tipos de estudos clínicos, entre os quais ensaios clínicos. É fulcral no desenvolvimento de novos medicamentos que, para obterem Autorização de Introdução no Mercado, devem comprovar a sua segurança e eficácia na indicação pretendida. Esta dissertação pretende discutir a evolução histórica, ética, regulamentar e legislativa da investigação clínica na Europa e em Portugal, focando a análise em ensaios clínicos com medicamentos. Adicionalmente, é caraterizado o quadro atual de realização de ensaios clínicos em Portugal, discutindo como se pode potenciar a competitividade do país. Para cumprir estes objetivos, procedeu-se a uma pesquisa bibliográfica e à condução de entrevistas. A investigação clínica acompanhou o desenvolvimento da medicina. As metodologias de investigação evoluíram progressivamente, sobretudo a partir do século XVIII. A atividade tornou-se prática corrente no século XX, durante o qual a ética assumiu especial relevância. Foram redigidos diversos códigos orientadores, como a Declaração de Helsínquia e o Relatório Belmont, e os princípios éticos assumiram caráter legal. Os princípios são revistos regularmente, acompanhando a evolução científica e tecnológica. A Diretiva n.º 2001/20/CE harmonizou as disposições legislativas dos Estados-Membros relativas à realização de ensaios clínicos com medicamentos. Foi transposta para o regime jurídico português pela Lei n.º 46/2004, que viria a ser revogada pela Lei da Investigação Clínica. Esta lei estabeleceu um novo quadro de referência para a investigação clínica e aumentou a competitividade do país, passando a regular todos os estudos clínicos. O Regulamento (UE) n.º 536/2014 facilitará a realização de ensaios clínicos multinacionais de medicamentos no espaço europeu e alterará o âmbito de aplicação da Lei da Investigação Clínica. Portugal é menos competitivo do que outros países europeus relativamente à realização de ensaios clínicos. Para que sejam atingidas as reais potencialidades do país, devem solucionar-se diversos problemas estruturais pela implementação de iniciativas adequadas, as quais poderão ser dinamizadas pela recém-criada Agência de Investigação Clínica e Inovação Biomédica. É imperativa a adoção de uma visão estratégica para o setor.

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Esta tese visa implementar um programa de Verificação Continuada de Processo, promovendo a qualidade dos medicamentos produzidos, estabelecendo uma metodologia sobre como implementá-lo e conceber um protocolo baseado numa avaliação crítica do processo de fabrico de um medicamento escolhido (forma sólida oral, comprimido). O medicamento considerado foi escolhido de acordo com a sua relevância para a empresa (por ser fabricado em grande número de lotes, ter duas dosagens e apresentar alguns problemas no processo de fabrico). O fabrico de formas sólidas orais é efetuado de acordo com um processo rígido, com especificações muito rigorosas sobre parâmetros variáveis que são monitorizados de forma univariada e onde o controlo se baseia na verificação da qualidade pós-processo. Para compreender completamente o processo de produção de um comprimido, é necessário atingir alguns objetivos: explicar a variabilidade de lote para lote, prever-se de forma fiável se um lote será ou não bem-sucedido a partir dos dados em processo e analisar todos os fatores que afetam a qualidade. A Verificação Continuada de Processo destina-se a garantir continuamente que o processo permanece controlado (o estado validado) durante o fabrico de um medicamento. A validação permite detetar desvios inesperados, bem como tendências dos resultados de cada parâmetro com impacto na qualidade final do produto promovendo a reavaliação do processo conduzindo à adoção de melhorias necessárias ao longo do ciclo de vida do produto. Existem vários benefícios provenientes da implementação da Verificação Continuada de Processo, destacando-se: a previsão do número de variações inesperadas no processo, que requerem investigação imediata e urgente; as melhorias do processo podem ser identificadas, justificadas e implementadas de forma mais eficiente; existem métodos mais robustos de controlo do processo e monitorização do processo de fabrico e os processos de revalidação podem ser evitados ou atenuados. Um pré-requisito para a conceção de um plano de Verificação Continuada de Processo, é a existência de uma Estratégia de Controlo para o produto, gerando informação relacionada com o funcionamento do processo de fabrico. De acordo com a Estratégia de Controlo definida para a Gestão do Ciclo de Vida do Produto (Etapa 3A-fase de avaliação de um número definido de lotes - inclui a avaliação de parâmetros críticos de processo, atributos críticos de qualidade e estimativa da variabilidade e capacidade do processo e, a Etapa 3B - permite a deteção de falhas no processo e a monitorização da robustez do produto/processo - realizada utilizando gráficos de controlo estatístico do processo e notificação de tendências), foi aplicada uma metodologia que permite a análise detalhada dos parâmetros de controlo em processo e parâmetros de equipamento, feita para as etapas do processo de Granulação, Secagem e Compressão necessárias ao fabrico do Medicamento escolhido. Para identificar variações no processo de fabrico do produto, recorrer a ferramentas estatísticas é a única forma de descrever a “capacidade” de qualquer processo, ou seja, de avaliar os dados estatisticamente que podem resultar na prevenção de uma falha final se a causa da variabilidade puder ser descoberta e retificada antes de esta atingir uma magnitude significativa. Os Atributos Críticos de Qualidade (CQAs) e Parâmetros Críticos do Processo (CPPs) foram avaliados de acordo com ferramentas estatísticas de processo, tais como as cartas de controlo e os Índices de Capacidade de Processo (Cpk e Ppk), que constituem o cerne da análise da Verificação Continuada de Processo, recorrendo à utilização do software Statgraphics XVI (os dados são introduzidos no software sob a forma de um ficheiro Excel® e é possível tratá-los de acordo com as ferramentas estatísticas que se deseja utilizar). As cartas de controlo são a melhor ferramenta estatística para determinar se um processo está ou não em controlo estatístico, sendo utilizada para monitorizar os parâmetros críticos de processo e atributos críticos de qualidade com o objetivo de detetar a ocorrência de variabilidade. Quanto aos Índices de Capacidade de Processo, o Cpk compara a tolerância admissível com a propagação estimada do processo e mede o quão próximo o processo está do objetivo e quão consistente é com a sua capacidade média aproximada; o Ppk incorpora informação tanto sobre a dispersão do processo como sobre a média do mesmo, sendo assim uma medida como o processo está a decorrer, indicando quanta variação apresenta e como é que esta variação irá afetar a capacidade do processo de satisfazer os requisitos. Através da análise de resultados, foram identificados parâmetros com resultados fora de especificação ou com baixos valores de Índices de Capacidade de Processo. As cartas de controlo e os Índices de Capacidade de Processo foram utilizados em conjunto para uma verificação eficaz do estado de controlo estatístico do processo. Nos parâmetros de controlo em processo (IPC), a Perda por Secagem na fase da Mistura Final foi o parâmetro identificado como mais crítico para o processo, uma vez que não estava em controlo estatístico de acordo com as cartas de controlo e os Índices de Capacidade de Processo Ppk (dosagem 1) = 0.33; Ppk (dosagem 2) = 0.44, Ppk<0.66 é considerado terrível. Quanto aos parâmetros de equipamento, para a Granulação, a Velocidade da Bomba Peristáltica foi identificada como o parâmetro mais crítico (não estava em controlo estatístico) para ambas as dosagens, através da observação das cartas de controlo e dos valores de Índices de Capacidade do Processo: Ppk (dosagem 1) = 0.20; Ppk (dosagem 2) = 0.27. Para a Secagem, a Temperatura do Ar de Entrada, o Volume de Ar de Entrada, a Temperatura do Ar de Saída e a Temperatura do Produto foram os parâmetros que não estavam em controlo estatístico de acordo com as cartas de controlo e os valores de Ppk<0.66 em ambas as dosagens. Para a Compressão, a Força de Pré-Compressão e a “Output Rate” foram os parâmetros que não estavam em controlo estatístico para ambas as dosagens de acordo com as cartas de controlo e os valores de Ppk<0.66. Em relação aos fatores que influenciaram os resultados fora de especificação, deve ser realçado que os parâmetros de equipamento tiveram mais influência nas mudanças no processo que levaram aos valores fora de especificação em comparação com os parâmetros de controlo em processo (IPC) – podem ser necessários rearranjos nos intervalos de especificação para esses parâmetros. Embora ao longo do processo de fabrico tenham havido resultados fora de especificação e baixos valores de Índices de Capacidade do Processo, os parâmetros de Secagem e Compressão foram os que tiveram mais parâmetros que não estavam em controlo estatístico, sendo assim consideradas as operações unitárias mais críticas no processo de fabrico. O programa de Verificação Continuada de Processo, que pode ser implementado pela empresa, ajudará a identificar a causa e a reduzir a variabilidade identificada no processo.

N-nitrosaminas, também referidas como nitrosaminas, são classificadas como agentes provavelmente ou possivelmente cancerígenos para os seres humanos, pertencem ao grupo dos compostos N-nitroso, que já demonstraram ser carcinogénicos, mutagénicos e teratogénicos em várias espécies de animais, e são considerados parte do cohort of concern pela Conferência Internacional de Harmonização dos Requisitos Técnicos para os Medicamentos para Uso Humano (ICH). O ser humano está diariamente exposto a várias fontes de nitrosaminas, sendo que estas podem ocorrer, por exemplo, em vários alimentos, como peixe e carne curados, e bebidas alcoólicas; na água potável; no ar; em cosméticos; em produtos de borracha, como chupetas e tetinas; e no fumo de tabaco, sendo esta última a maior fonte de exposição exógena a esta classe de contaminantes. Adicionalmente, estes compostos podem ainda ser formados no organismo, maioritariamente no estômago, e é muito provável que a formação endógena seja a maior fonte de exposição humana. Apesar da ampla distribuição destes contaminantes, a sua presença não era esperada em medicamentos até junho de 2018. Nessa altura as autoridades europeias identificaram a presença da nitrosamina N-nitrosodimetilamina (NDMA) na substância ativa valsartan. Subsequentemente outras nitrosaminas foram também identificadas em lotes de medicamentos valsartan e outros medicamentos da família sartan foram também implicados, levando a recolhas de mercado dos lotes afetados em tudo o mundo. Foi desencadeada uma avaliação do impacto da contaminação com nitrosaminas no balanço risco-benefício destes medicamentos, que estimou que o potencial excesso de risco de cancro seria muito baixo nos níveis em que estas impurezas foram encontradas, concluindo, portanto, que o risco associado à paragem do tratamento seria superior. Até ao momento, estas impurezas foram detetadas também em lotes das seguintes substâncias ativas (e/ou produto acabado) não pertencentes à família sartan: pioglitazona, ranitidina, metformina e rifampicina. De uma forma geral, a formação de nitrosaminas resulta da combinação de aminas nitrosáveis e nitrito ou outros agentes nitrosantes, usualmente na presença de ácido. No entanto, estas impurezas podem também ser introduzidas por contaminação resultante de outras fontes, como por exemplo do uso de equipamento com uma limpeza deficiente e/ou de solventes reciclados. Neste contexto, como medida de precaução, em setembro de 2019 foi solicitado aos titulares de autorizações de introdução no mercado de todos os medicamentos contendo substâncias ativas sintetizadas quimicamente, que efetuassem uma revisão aos seus medicamentos no sentido de avaliar o risco de nitrosaminas poderem estar presentes nos seus produtos, testar todos os medicamentos com potencial risco e implementar medidas de mitigação apropriadas. O objetivo deste projeto prende-se com a primeira parte desse pedido, pretendendo propor uma metodologia que permita à empresa Generis Farmacêutica, S.A., identificar as substâncias ativas e respetivos produtos acabados em risco de formação ou contaminação com nitrosaminas. O desenvolvimento dessa metodologia começou com uma revisão de literatura para identificar as possíveis causas para a presença destas impurezas em medicamentos, que foram de seguida organizadas em três grupos através da construção de um diagrama espinha de peixe: substância ativa, excipientes e produto acabado. Os seguintes fatores foram considerados na avaliação da substância ativa e dos excipientes: presença de precursores de nitrosaminas e condições do processo (com foco no pH e temperatura); equipamento utilizado no processo (uso dedicado ou multipropósito e composição dos agentes de limpeza); uso de solventes ou outros materiais recuperados/reciclados e transporte de solventes “frescos”; uso de matérias-primas, materiais de partida e intermediários contaminados; qualidade da água utilizada no processo (presença de nitritos, nitratos e nitrosaminas); material de embalagem; e no caso da substância ativa foi ainda averiguada a possibilidade de existência processos de degradação que levassem à formação de nitrosaminas ou dos seus precursores durante o prazo de validade. No caso do produto acabado foram considerados alguns fatores também considerados para as avaliações dos outros dois grupos, nomeadamente o equipamento e a qualidade da água utilizados no processo; o material de embalagem utilizado para o produto em bulk e na embalagem primária do produto acabado; e foi também averiguada a possibilidade de existência de processos de degradação do medicamento que resultem na formação de nitrosaminas potencialmente durante o seu armazenamento. Além destes, foi ainda considerada a formulação (possíveis interações entre a substância ativa e os excipientes, em conjunto com a possibilidade do uso de matérias contaminadas com nitrosaminas ou com os seus precursores) juntamente com as condições de processo. De seguida foi aplicada a ferramenta de avaliação de risco recomendada pela Agência Europeia do Medicamento (EMA na sigla inglesa), a FMEA. Para tal, foram sugeridos vários níveis de probabilidade de ocorrência destas impurezas na substância ativa, excipientes, ou produto acabado, considerando situações hipotéticas para cada uma das possíveis causas identificadas em cada um desses grupos. Vários níveis foram também sugeridos para pontuar o parâmetro da detetabilidade, tendo em conta a existência de métodos analíticos capazes de detetar estas impurezas caso existisse risco da sua presença. Foi também proposta uma equação para estimar a severidade (impacto) que a presença destas impurezas teria no doente do produto em avaliação, considerando (1) a máxima dose diária do medicamento; (2) a duração do tratamento; (3) a indicação terapêutica que incluía o público ao qual se destina o medicamento e o local de ação (ação local ou sistémica); e (4) o número de pessoas tratadas. Foi atribuída uma importância superior aos três primeiros fatores (30%) pelas seguintes razões: é sabido que o processo de carcinogénese destes compostos envolve a formação de aductos de DNA, havendo já casos documentados do aumento desta com a dose de nitrosamina, e que a capacidade das enzimas que reparam o DNA é limitada; além disso baseado em estudos animais foi apontado que fetos, bebés e crianças podem apresentar um risco superior de alterações mutagénicas decorrentes da exposição a nitrosaminas. A restante percentagem (10%) foi atribuída ao último fator. A multiplicação das pontuações de severidade, probabilidade e detetabilidade permite obter o valor de RPN, que será tanto mais alto quanto maior for o risco associado à causa em estudo, e de forma a possibilitar a classificação do risco os seguintes limites foram assumidos: risco baixo - RPN ≤ 11; risco médio - 12 ≤ RPN ≤ 26; risco alto - RPN ≥ 27. A estratégia para estimar o risco global da presença de nitrosaminas num dado medicamento foi delineada durante a avaliação do primeiro medicamento em estudo e foi depois aplicada a um segundo medicamento. O primeiro medicamento em estudo foi o Losartan Generis 50mg/100 mg, como tal, foi recolhida toda a informação necessária para pontuar a probabilidade de ocorrência de nitrosaminas na substância ativa losartan de potássio, em cada um dos excipientes e no produto acabado para cada uma das possíveis causas apontadas em cada um desses grupos; e para pontuar também os parâmetros de severidade e detetabilidade. Seguidamente, com os valores de probabilidade, severidade e detetabilidade obtidos calculou-se o RPN para cada uma das causas em estudo. De forma a obter a classificação global do risco foram atribuídas diferentes ponderações a cada uma das causas em avaliação de acordo com a sua importância/contribuição estimada para o risco global da presença destas impurezas em cada um dos grupos em estudo. Foi de seguida proposto que a pior classificação obtida entre a substância ativa, os excipientes e o produto acabado fosse assumida como a classificação global do risco da presença de nitrosaminas no medicamento. Com esta estratégia, foi obtido um valor final de RPN para o medicamento Losartan Generis de 8, o que de acordo com os limites referidos acima VI corresponde a um risco baixo. No entanto, importa referir que esse nível de risco foi obtido apenas após o fabricante da substância ativa ter implementado medidas de mitigação que levaram a uma revisão do nível de risco inicialmente elevado. Seguindo o mesmo racional para o segundo medicamento em estudo, a Ranitidina Generis 150mg/300mg, o valor final de RPN obtido foi 33, o que corresponde a um risco elevado. Até ao momento ainda não foi possível rever o nível de risco obtido para este medicamento, dado que ainda não foram identificadas medidas de mitigação apropriadas. Os resultados obtidos para os medicamentos Losartan Generis e Ranitidina Generis estão em concordância com os resultados das respostas regulatórias em ambos os casos. No caso do primeiro medicamento, inicialmente o CEP da substância ativa foi suspenso com base na avaliação do processo de fabrico que identificou potencial para a formação de nitrosaminas. No entanto, este foi restaurado após o produtor da substância ativa ter investigado as possíveis causas para a formação destas impurezas e ter implementado controlos de rotina adicionais. Já no caso da ranitidina, todos os medicamentos que contêm esta substância ativa foram suspensos da União Europeia. Assim sendo, acredita-se que a metodologia proposta possa ser efetivamente aplicada a outros medicamentos.

A via ubiquitina-proteossoma é um dos métodos celulares utilizados para a degradação de proteínas, onde ocorre a formação de uma cadeia de ubiquitina na proteína alvo, sinalizando-a para degradação no proteossoma. Para a formação da cadeia de ubiquitina é necessária a presença do enzima ativador de ubiquitina (E1), do enzima conjugador (E2) e do ubiquitina ligase (E3). O E1 ativa a ubiquitina, que uma vez ativada é transferida para o E2. O E3 vai servir como adaptador entre o E2 e a proteína alvo, permitindo a transferência da ubiquitina. Tirando partido da via ubiquitina-proteossoma, surgiu uma nova classe de compostos, que tem como objetivo a degradação de proteínas - os PROTACs (Proteolysis-Targeting Chimeras). Estes ligam-se simultaneamente à proteína alvo e ao E3 escolhido, permitindo que ocorra a formação de uma cadeia de ubiquitina que irá sinalizar a proteína para degradação no proteossoma. De forma a possibilitar a interação entre a proteína de interesse e o E3, os PROTACs são constituídos por três componentes: um ligando para a proteína alvo, um ligando para um E3 e um linker que une ambos os ligandos. Apesar de haver um elevado número de E3s, os PROTACs desenvolvidos têm como principais alvos o cereblon (CRBN), o von Hippel-Lindau (VHL) ou o cIAP (cellular inhibitor of apoptosis protein). O linker, para além de unir os ligandos, vai influenciar a interação entre as duas proteínas, devendo o seu tamanho e composição ser o adequado para as aproximar e permitir a transferência da ubiquitina. Uma grande variedade de proteínas já foi degradada usando PROTACs, estando a maioria relacionada com o cancro, embora algumas tenham um papel em doenças neurodegenerativas. Atualmente, encontram-se dois PROTACs em ensaios clínicos, um para o tratamento do cancro da próstata e outro da mama. Estes têm como objetivo a indução da degradação do recetor de androgénio e recetor de estrogénio, respetivamente. Uma das vantagens apontadas para o uso de PROTACs em detrimento dos inibidores de proteínas é que os PROTACs só necessitam de se ligar à proteína o tempo suficiente para que ocorra a ubiquitinação, podendo ser usados posteriormente para induzir a ubiquitinação de uma outra proteína. Por sua vez, os inibidores de proteínas, necessitam de se manter ligados à proteína para exercer o seu efeito. Deste modo, a concentração de PROTAC utilizada poderá ser inferior em comparação à do inibidor. O RIPK2 (Receptor-interacting protein Kinase 2) é um enzima que pertence às vias do NOD1 (Nucleotide binding oligomerization domain 1) e NOD2, participando na ativação do NF-κB (nuclear factor-κB). O NF-κB encontra-se associado ao IκB (inhibitor of kappa B) no citoplasma, onde permanece inativo. Para ser ativado, e poder migrar para o núcleo, é necessário que se dissocie do IκB. Nas vias do NOD1 e NOD2, o reconhecimento de peptidoglicanos bacterianos leva ao recrutamento do RIPK2 e à sua consequente polimerização. Posteriormente, o RIPK2 liga-se simultaneamente ao TAK1 (Transforming growth factor β-activated kinase 1) e ao complexo IκB cinase (IKK), através da sua subunidade IKKγ, permitindo a fosforilação da subunidade IKKβ por parte do TAK1. Uma vez fosforilado, o IKK levará à fosforilação do IκB que terá como consequências a sua dissociação do NF-κB e a sua degradação no proteossoma. O NF-κB, uma vez dissociado do IκB, poderá então migrar para o núcleo. A regulação destas vias pode ocorrer por remoção das cadeias de ubiquitina do RIPK2 ou impedimento da interação do RIPK2 com o NOD1, NOD2 ou XIAP. O papel que o RIPK2 tem nas vias do NOD1 e NOD2, faz com que seja considerado um alvo terapêutico no tratamento de patologias associadas a alterações no seu funcionamento, como a doença de Crohn, colite ulcerosa ou cancro da mama. Os complexos metálicos têm tido um papel importante quer no diagnóstico, quer no tratamento de doenças. Estes possuem características, tais como, a apresentação de maior diversidade de estruturas, devido à possibilidade de terem números de coordenação superiores a quatro, e poderem trocar ligandos com as biomoléculas, que os podem tornar atrativos em comparação com as moléculas orgânicas. Após a aprovação da cisplatina como agente anticancerígeno, houve um aumento do interesse no desenvolvimento de complexos metálicos com propriedades terapêuticas, não só de platina, mas também de ruténio, paládio, ouro ou cobre. Os complexos de ruténio têm mostrado ser promissores, tendo os complexos NAMI-A, KP1019 e IT-139 avançado para ensaios clínicos, embora nenhum tenha sido aprovado. Atualmente, encontra-se em ensaios clínicos de fase II o TLD1433, um complexo utilizado para terapia fotodinâmica. Apesar de todos os complexos de ruténio que seguiram para ensaios clínicos serem agentes anticancerígenos, também têm sido desenvolvidos complexos com o intuito de serem aplicados como antibióticos e antiparasitários. Os ligandos do centro metálico vão ter um papel importante na função que este irá adquirir. A utilização de arenos permite a intercalação com DNA. No caso dos complexos com aplicação em terapia fotodinâmica são utilizadas polipiridinas como ligandos. Se o objetivo for inibir enzimas pode ser coordenado ao centro metálico um inibidor do enzima alvo, como é o caso da inibição de cinases ao coordenar estaurosporina com um centro metálico. Neste projeto pretendemos demonstrar como a introdução de um núcleo metálico no linker do PROTAC poderá melhorar as suas propriedades físico-químicas e biológicas, como a permeabilidade, a solubilidade ou a biodistribuição. Para isso, temos como primeiro objetivo o desenvolvimento de um PROTAC orgânico que contem no seu linker uma bipiridina. O segundo objetivo será a obtenção de dois MPROTACs (metal-linked PROTACs), que diferem nos ligandos espectadores (fenantrolina ou batofenantrolina), através da coordenação da bipiridina do PROTAC orgânico com um complexo de ruténio. Tendo como modelo um PROTAC que induz a degradação do RIPK2, pretendemos desenvolver um PROTAC orgânico que leva à degradação da mesma proteína alvo, mas em vez do VHL pretendemos recrutar como E3 o CRBN. Assim, o nosso PROTAC orgânico é constituído pelo ligando do RIPK2 (24), o ligando do CRBN (28) e um linker que foi dividido em três partes: a [2,2’-bipiridina]-4,4’-dicarboxílico (26) e as porções que fazem a ponte entre a bipiridina e os ligandos (25 e 27). A síntese do PROTAC teve início na obtenção do ligando do RIPK2, onde encontramos adversidades no último passo (a desmetilação do 35), que foram resolvidas ao realizar a reação em sistema fechado. A síntese do ligando do CRBN ocorreu em dois passos, tendo sido necessário no segundo um aumento de pressão para que a reação fosse completa. Para a síntese do 25 e do 27 foi necessária a utilização de grupos protetores antes de realizar a tosilação e substituição nucleofílica, respetivamente. Uma vez com os diferentes componentes do PROTAC prontos, chegou o momento de uni-los. Em primeiro lugar, sintetizámos o composto 50, ao unir o ligando do RIPK2 e o 25, sem adversidades. O passo seguinte foi a condensação do 26 com o 27, no entanto, não obtivemos os resultados esperados. Como alternativa, convertemos os ácidos carboxílicos do 26 em cloretos de acilo antes de realizarmos a condensação com o 27 e metanol. Com este método, obtivemos resultados positivos apenas quando se encontrava presente piridina. Ao repetir a condensação, desta vez com 50 em vez de metanol, obtivemos 54 e 55, no entanto não foi possível purificar nenhum deles. Embora não tenhamos conseguido cumprir nenhum dos objetivos a que nos propusemos, fizemos avanços nesse sentido.

O fígado é um órgão fundamental para diversos processos fisiológicos, incluindo a biotransformação de muitos fármacos. O metabolismo mitocondrial depende de processos regulatórios complexos para satisfazer as necessidades energéticas da célula. O papel da disfunção mitocondrial como base fundamental dos efeitos iatrogénicos induzidos por determinados fármacos constitui o âmbito da presente investigação. O complexo piruvato desidrogenase (PDC) é uma das proteínas multiméricas maiores e mais complexas que representa um papel principal no metabolismo energético. Este complexo é responsável pela formação de acetil-CoA, um metabolito de sinalização na interface de vias cruciais. Devido à sua relevância, a regulação do PDC tem sido amplamente estudada. Este complexo é composto por quatro subunidades catalíticas distintas: piruvato desidrogenase (E1/PDH), dihidrolipoamida transacetilase (E2/DLAT), dihidrolipoamida desidrogenase (E3/DLD) e a proteína de ligação a E3 (E3BP). É importante destacar que a E3 para além de fazer parte do PDC também se encontra envolvida noutros quatro complexos mitocondriais: o complexo a-cetoglutarato desidrogenase, a-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, a-cetoadipato desidrogenase e glicina descarboxilase. Portanto, inferimos que qualquer efeito associado a um fármaco que afecte a subunidade E3 e/ou na atividade do PDC pode induzir efeitos pleiotrópicos em células e tecidos. Relativamente à localização do PDC foi considerada durante anos como estritamente mitocondrial. Mas, curiosamente, a sua presença e função no núcleo foram demonstradas, produzindo acetil-CoA, um substrato para a acetilação de histonas. A translocação dinâmica do PDC mitocondrial para o núcleo liga o metabolismo e a epigenética, uma via determinante para a homeostase energética. O ácido valpróico (VPA) é um fármaco antiepilético usado mundialmente que tem sido reconhecido como um potencial indutor de teratogenicidade ou toxicidade hepática leve a severa, na qual os mecanismos subjacentes ainda não são totalmente compreendidos. Este fármaco também tem sido reconhecido como um inibidor da desacetilase de lisina em proteínas (KDACi), que está relacionado com as suas propriedades anticancerígenas. A nível molecular, este fármaco é um ácido gordo de cadeia ramificada que é capaz de desencadear efeitos significativos no metabolismo energético. A demonstração da formação do valproil-Coenzima A (valproil-CoA, VP-CoA), a interação com a via oxidativa de aminoácidos de cadeia ramificada, a potencial interferência com o transporte do piruvato e com a taxa de oxidação do piruvato fornecem evidencias inequívocas de que este fármaco tem efeitos importantes no metabolismo celular. Nas últimas décadas, diversos estudos demostraram uma disfunção mitocondrial potencialmente associada ao VPA com efeitos na oxidação do piruvato, a-cetoglutarato ou cetoácidos de cadeia ramificada in vitro e no metabolismo da glicina in vivo. E ainda, os efeitos inibitórios do VPA na oxidação do piruvato e do a-cetoglutarato em mitocôndrias de fígado de rato foram relacionados à inibição de E3. Com efeito, em presença de certos substratos respiratórios demonstrou-se que o VPA pode comprometer a função mitocondrial, diminuindo o consumo de oxigénio e a síntese de ATP. Este efeito inibidor sobre a fosforilação oxidativa era claro quando a respiração mitocondrial era sustentada por piruvato e glutamato, não sendo observado em presença de succinato. Com base nos dados disponíveis, coloca-se a hipótese de os efeitos moleculares induzidos pelo VPA poderem associar-se a uma interação com a subunidade E3. Assim um dos objetivos específicos do presente trabalho é precisamente investigar se o principal metabolito mitocondrial do VPA pode induzir a inibição da subunidade E3 do PDC que por sua vez, pode ter impacto na formação de acetil-CoA e no fluxo de metabolitos através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). De igual modo postulamos que as alterações induzidas por fármacos no PDC (ou E3) no núcleo possam estar relacionadas com a atividade KDAC e com o estado de acetilação das histonas. Para investigar estas hipóteses foi utilizado tecido hepático, lisados mitocondriais e alíquotas de urina de ratos Wistar expostos ao VPA com o objetivo de elucidar os mecanismos induzidos pelo fármaco na toxicidade hepática. O plano experimental tem como objetivos: i) elucidar os efeitos induzidos pelo VPA nos perfis dos metabolitos, nomeadamente no ciclo do TCA, pelo que pretendemos analisar ácidos orgânicos em amostras de urina; ii) esclarecer se o VPA in vivo pode contribuir para a inibição da subunidade E3 usando mitocôndrias de fígado de rato; iii) esclarecer os mecanismos da atividade inibitória mediada pelo VPA na desacetilação de histonas; iv) analisar frações subcelulares incluindo núcleos de amostras tratadas com VPA, a fim de identificar a presença de PDC, mais especificamente da subunidade E3, bem como proteínas acetiladas e respetiva expressão diferencial; v) contribuir com uma análise integrada (atividade enzimática, análise de metabolitos e níveis de proteína) para elucidar os efeitos associados ao VPA na subunidade E3 e o respetivo impacto sobre os diferentes complexos nos quais esta participa. Para investigar estas hipóteses foram analisados perfis de ácidos orgânicos, por cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), em alíquotas de urina de ratos Wistar expostos ao VPA. Além disso, também se sintetizou o principal metabolito mitocondrial do fármaco, valproil-CoA, para ser testado in vitro como um potencial inibidor da atividade da E3. Para tal, foram realizados estudos cinéticos por ensaios espectrofotométricos com a enzima purificada. Os resultados obtidos sugerem o comportamento alostérico típico da enzima E3, já previamente reportado em dois diferentes organismos: Acidianus ambivalens e Corynebacterium glutamicum. Os dados obtidos de cinética enzimática demonstraram que VP-CoA inibe claramente a atividade de E3 in vitro, determinada no sentido reverso (taxa de oxidação de NADH). Um efeito inibitório semelhante na atividade da E3 foi confirmado usando lisados mitocondriais de fígado de ratos expostos ao VPA (in vivo) em relação aos respectivos controlo não expostos ao fármaco. Além disso, os níveis urinários de intermediários do ciclo do TCA (nomeadamente o ácido fumárico, málico, cis-aconítico, cítrico e isocítrico) mostraram ser claramente modificados com a administração do fármaco, onde foi observado uma diminuição da excreção nos níveis dos ácidos succínico, a-cetoglutárico e a-cetoadípico associada ao VPA. Foi também demonstrado um aumento da excreção de ácido láctico, nomeadamente na dose mais elevada de VPA. Portanto, podemos afirmar que os mecanismos de inibição da oxidação do piruvato associados a este fármaco são múltiplos e não totalmente esclarecidos. A relevância do VPA, com um espectro crescente de reivindicações farmacológicas, como antiepilético, anticonvulsivo, agente estabilizador do humor ou coadjuvante em esquemas combinatórios anticancerígenos, é indiscutível. No entanto, demonstrou desencadear hepatotoxicidade ou teratogenicidade potencial, onde o seu papel como um KDACi reconhecido não está totalmente elucidado. Como conclusão, estes estudos demonstram que a formação de valproil-CoA tem um papel relevante nos mecanismos de disfunção do metabolismo energético mitocondrial, nomeadamente através da inibição da atividade de E3. O comprometimento dos complexos enzimáticos associados à subunidade E3 e a dependência intrincada dos níveis de NAD+/NADH podem desempenhar um papel central na patogénese da toxicidade hepática induzida por fármacos.

Atualmente a qualidade e a variedade dos alimentos consumidos são de grande importância não só pelo seu valor nutricional mas também, cada vez mais, pela sua contribuição para a saúde dos consumidores, através do contributo de uma diversidade de compostos, designados por compostos bioativos, aos quais tem sido atribuída a capacidade de exercer influência na redução do risco de desenvolver doenças crónicas não transmissíveis, inflamações, doenças cardiovasculares, entre outras. Todas as estratégias que conduzam ao controlo dos fatores de risco que promovem estas doencas cronicas sao muito importantes. A ingestao de alimentos ricos em antioxidantes e outros compostos bioativos pode ser uma destas estratégias. O leite e os lacticínios são considerados excelentes alimentos e vêm sendo reconhecidos como alimentos funcionais dado conterem uma diversidade notável de compostos com importante atividade biológica. No entanto, em comparação com outros alimentos, os lacticínios apresentam algum deficit de propriedades antioxidantes, designadamente de presença de compostos fenólicos. Este trabalho revê as propriedades nutricionais e funcionais do leite e do queijo, produto lácteo de consumo em expansão, e perspetiva como outra estratégia possível o incremento das propriedades antioxidantes deste produto através da utilização de fontes naturais destes compostos. Para este fim propõe-se a utilização de extratos de folha de cardo Cynara cardunculus L. como aditivo natural e fonte de compostos bioativos.