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Goals of work: The aims of this study were (1) to evaluate quality of life (QoL), nutritional status and dietary intake taking into account the stage of disease and therapeutic interventions, (2) to determine potential interrelationships, and (3) to quantify the relative contributions of the cancer, nutrition and treatments on QoL. Patients and methods: In this prospective cross-sectional study conducted in 271 head and neck, oesophagus, stomach and colorectal cancer patients, the following aspects were evaluated: QoL (EORTC-QLQ C30), nutritional status (percent weight loss over the previous 6 months), usual diet (comprehensive diet history), current diet (24-h recall) and a range of clinical variables. Main results: Usual and current intakes differed according to the site of the tumour ( P=0.02). Patients with stage III/IV disease showed a significant reduction from their usual energy/protein intake ( P=0.001), while their current intakes were lower than in patients with stage I/II disease ( P=0.0002). Weight loss was greater in patients with stage III/IV disease than in those with stage I/II disease ( P=0.001). Estimates of effect size revealed that QoL function scores were determined in 30% by cancer location, in 20% by nutritional intake, in 30% by weight loss, in 10% by chemotherapy, in 6% by surgery, in 3% by disease duration and in 1% by stage of disease. Likewise in the case of symptom scales, 41% were attributed to cancer location, 22% to stage, 7% to nutritional intake, 7% to disease duration, 4% to surgery, 1% to weight loss and 0.01% to chemotherapy. Finally for single items, 30% were determined by stage, 20% by cancer location, 9% by intake, 4% by surgery, 3% by weight loss, 3% by disease duration and 1% by chemotherapy. Conclusions: Although cancer stage was the major determinant of patients' QoL globally, there were some diagnoses for which the impact of nutritional deterioration combined with deficiencies in nutritional intake may be more important than the stage of the disease process.

A grande dependência nos combustíveis fósseis, tanto para a produção de energia como para o sector dos transportes, constitui a maior contribuição antropogénica para aumento do efeito de estufa da atmosfera e para aumento médio da temperatura da Terra, pelo que é cada vez mais importante reduzir a sua utilização. Existem diversas alternativas aos combustíveis fósseis, sendo que a energia solar fotovoltaica é uma das melhores opções, não só devido ao enorme potencial de energia solar disponível em todo o planeta, como devido à sua modularidade, possibilidade de funcionar em sistemas isolados da rede elétrica, e às baixas emissões de dióxido de carbono associadas ao fabrico dos sistemas fotovoltaicos. Para aumentar a competitividade da energia fotovoltaica, é essencial reduzir cada vez mais o seu custo de produção e melhorar a sua eficiência de conversão. A indústria fotovoltaica é essencialmente baseada nas tecnologias de silício cristalino que representam mais de 80% do mercado. O presente trabalho tem por objetivo determinar a estrutura de absorção de luz que maximiza o desempenho ótico de amostras de silício cristalino. Para a realização desta dissertação, foi usado o método de gravação química assistida por metal (em inglês, Metal-assisted chemical etching (MACE)). O impacto da texturização (ou gravação) foi analisado, caracterizando a morfologia das estruturas criadas e a refletividade das amostras. A gravação das nanoestruturas foi feita usando o metal prata (Ag), como catalisador, presente no sal metálico de nitrato de prata (AgNO3). Como agentes de gravação foram utilizados o ácido fluorídrico (HF) e peróxido de hidrogénio H2O2. Durante o trabalho, foram utilizados substratos de silício monocristalino, tipo p dopado com boro, resistividade de 1.7 Ω.cm, espessura de 330 ± 30 μm e com orientação de (1 0 0). Durante os testes de texturização efetuados, analisou-se a impacto de diversos parâmetros na reação tais como: razão entre as concentrações de HF e H202; temperatura e existência de pré-tratamento com solução CP4. Com a aplicação do método MACE foi possível baixar a refletividade efetiva de amostras de silício de 35% para 3%. Conclui-se que este é um método simples e eficaz de melhorar o desempenho ótico das amostras de silício.

Studies over the past years indicate that there is extensive coupling between nuclear export of mRNA and pre-mRNA processing. Here, we visualized the distribution of exon junction complex (EJC) proteins and RNA export factors relative to sites of abundant pre-mRNA synthesis in the nucleus. We analyzed both HeLa cells infected with adenovirus and murine erythroleukemia (MEL) cells stably transfected with the human beta-globin gene. Using in situ hybridization and confocal microscopy, we observe accumulation of EJC proteins (REF/Aly, Y14, SRm160, UAP56, RNPS1, and Magoh) and core spliceosome components (U snRNPs) at sites of transcription. This suggests that EJC proteins bind stably to pre-mRNA cotranscriptionally. No concentration of the export factors NXF1/TAP, p15, and Dbp5 was detected on nascent transcripts, arguing that in mammalian cells these proteins bind the mRNA shortly before or after release from the sites of transcription. These results also suggest that binding of EJC proteins to the mRNA is not sufficient to recruit TAP-p15, consistent with recent findings showing that the EJC does not play a crucial role in mRNA export. Contrasting to the results obtained in MEL cells expressing normal human beta-globin transcripts, mutant pre-mRNAs defective in splicing and 3'end processing do not colocalize with SRm160, REF, UAP56, or Sm proteins. This shows that the accumulation of EJC proteins at transcription sites requires efficient processing of the nascent pre-mRNAs, arguing that transcription per se is not sufficient for the stable assembly of the EJC.

Age-related Macular Degeneration (AMD) is a progressive neurodegenerative retinal disease and the second leading cause of blindness and visual impairment among the elderly. The presence of drusen above or under the retinal pigment epithelium (RPE) is the hallmark of dry-AMD but the mechanisms underlying the formation of these deposits are still not well understood, neither it’s correlation with the accumulation of lipofuscin detected in AMD patients’ Fundus Autofluorescence examinations. Also, the role of vascular changes in the development of AMD is still to be explained. Due to the urgent need to understand the molecular mechanisms underlying the development and progression of this disease, researchers have been trying to find new and more refined imaging techniques to study the retina of AMD patients, as well as new imaging software to help diagnosis and research. The goal of this dissertation was to develop algorithms and incorporate them into a Graphical User Interface (GUI) to help in diagnosis and research of this disease, using MALTAB. This tool will facilitate research on these open questions about the mechanisms underlying the patho genesis and progression of dry-AMD and will also be useful in the Clinical practice since it will deliver quantitative information about drusen, autofluorescence and vasculature. — The eye is one of the most complex organs in the human body and its performance is usually affected by ageing. Age-related Macular Degeneration (AMD) is a progressive neurodegenerative retinal disease and the second leading cause of blindness and visual impairment among the elderly. There are two types of AMD, the dry-AMD and the wet-AMD. In either form of the disease the mac ular region of the retina is affected leading to a progressive loss of central vision. The presence of drusen above or under the retinal pigment epithelium (RPE) is the hallmark of dry-AMD but the mechanisms underlying the formation of these deposits are still not well understood, neither it’s correlation with the accumulation of lipofuscin detected in AMD patients’ Fundus Autofluorescence examinations. Also, the role of vascular changes in the development of AMD is still to be explained. Due to the urgent need to understand the mechanisms underlying the development and progression of AMD, researchers and clinicians have been trying to find new and more refined imaging techniques to study the retina of patients with AMD, as well as imaging software to help on diagnosis and research. Nowadays, most of the imaging segmentation and measurements of relevant physical properties to study AMD are still performed manually, being the results vulnerable to human errors and can be biases by the person who performs the assessment. The goal of this thesis was to develop a tool to help on diagnosis and research of AMD. Several algorithms were developed and then incorporated in a graphical user interface. The platform used for the development of the algorithms and the interface was MATLAB, since it has a library dedicated to Imaging Processing and also an environment for Development of Graphical Interfaces. One of the algorithms developed in the scope of this thesis was to segment retinal layers in images of Optical Coherence Tomography (OCT). These images are called B-scans and they show the internal structure of the retina and the choroid. The segmentation of the retinal layers is performed after a pre-processing and alignment of the B-scans, and it is based in the intensity variations between the layers. Another segmentation algorithm was also developed for drusen detection. This segmentation is per formed on the en face images obtained from the axial cuts on the tomographic examinations. Besides the segmentation, this algorithm also classifies drusen regarding their morphology and physical properties. In what concerns the autofluorescence, drusen found previously can be automatically classified in hyper, iso or hypo-autofluorescent. This is obtained by comparing the location of drusen with the autofluorescence examination of the same patient. Finally, an algorithm that allows the analysis of the images obtained from the Optical Coherence Tomography Angiography (OCT-A) was also developed. This algorithm provides a visualization of the different plexus, so that the blood flow can be easily studied in the retina and in the choroid. The algorithm developed to segment the retinal layers was compared with other similar softwares, Spectralis from Heidelberg and OCT-Explorer from University of Iowa. The performance of the algorithm developed in the scope of this thesis showed promising results. However, these results would need to be validated by an expert in order to draw any concrete conclusions. The lack of validations is, in fact, one of the most significant limitations of the work presented here. Despite all the limitation, we believe in the potential of this work and we hope that this interface will be useful to easily study the progression of AMD. This thesis is inserted in the context of a research group that is dedicated to study the molecular mechanisms of diseases which affect vision. After being refined and validated, this interface will have direct impact on the organization and development of studies, since it will facilitate the analysis, classification and monitoring of patient’s exams.

Group B streptococci are emerging as a cause of serious infection worldwide. The capsular polysaccharides are not only important virulence factors but also the target of vaccine development efforts. Serotypes III (24.6%), V (23.4%), Ia (17.8%), and II (16.3%) were the most prevalent among 252 Streptococcus agalactiae isolates collected during 1999-2002 in the largest hospital of Lisbon, Portugal. The substantial proportion of bacteremic patients (17 neonates and 21 adults) in this period illustrates the present importance of S. agalactiae as a cause of invasive disease. All isolates were fully susceptible to penicillin (MIC(50) = 0.064 microg/ml; MIC(90) = 0.094 microg/ml, range 0.008-0.094), cefotaxime, chloramphenicol, ofloxacin, and vancomycin. Resistance was found to tetracycline (75.4%), erythromycin (10.7%), and clindamycin (9.9%). Of the 27 erythromycin-resistant isolates, 70.4% had the cMLS(B), 22.2% the iMLS(B), and 7.4% the M phenotype. All isolates presenting the M phenotype carried the mef(A) gene, whereas the erm(B) gene was found in a large fraction of MLS(B) isolates (n = 17) and only a small proportion (n = 7) the erm(A) gene [erm(TR) variant]. All isolates carried a single macrolide-resistance determinant. Macrolide resistance was not attributable to a single clone as evidenced by distinct serotype and pulsed-field gel electrophoretic profiles. Careful surveillance of S. agalactiae invasive infections in Portugal is essential, and the treatment or intrapartum prophylaxis of patients who are allergic to penicillin should be guided by contemporary resistance patterns observed in the country.

A conservação dos carnívoros é considerada prioritária devido à importância destes para os ecossistemas e à ameaça séria de extinção que enfrentam em todo o mundo. Jaguares (Panthera onca) e pumas (Puma concolor), os maiores felinos do Brasil e das Américas, estão em declínio devido a ameaças como a perda de habitat e a redução do número de presas. Como resposta a estas adversidades, surge uma maior necessidade destes felinos recorrerem a gado como fonte de alimentação, e dada a expansão das comunidades humanas, a oportunidade de o fazerem aumenta. Consequentemente, aumenta a sua perseguição por criadores de gado em busca de retaliação, podendo resultar numa maior mortalidade dos jaguares e pumas. Ambas as espécies ocorrem na Caatinga, um ecossistema que só existe no Brasil. É caracterizado por uma longa história de impactos antropogénicos na biodiversidade, principalmente a transformação excessiva de áreas de vegetação nativa para práticas de agricultura e agropecuária e, mais recentemente, para o estabelecimento de empreendimentos de energia eólica e solar. Estes impactos e o ainda ténue conhecimento do bioma – número reduzido de trabalhos científicos, falta de menção em trabalhos de escala global e dúvidas na sua nomenclatura - surgem como desafios para desenvolver investigação e promover a coexistência entre pessoas e felinos. Existe, portanto, uma necessidade crescente de abordar a conservação como um assunto interdisciplinar, tendo em consideração a vertente socio-ecológica indispensável para melhorar as relações entre os seres humanos e a vida selvagem. A educação é essencial neste contexto, porque permite um aumento do conhecimento e consciencialização, uma alteração de comportamentos e um aumento de atitudes positivas para com a natureza. Neste estudo, gerações mais jovens foram utilizadas como amostra devido à sua importância como futuros conservacionistas e decisores, e à sua influência nos adultos. Este estudo foi realizado em escolas dos municípios de Sobradinho e Juazeiro, ambos localizados no estado da Bahia e dois dos seis municípios que fazem parte do Boqueirão da Onça. Esta região inclui duas áreas protegidas e uma das maiores ameaças aos jaguares e pumas é a retaliação por parte de criadores de gado que culpam estes carnívoros pelas perdas de gado. O objetivo deste trabalho foi comparar o sucesso de dois tipos diferentes de intervenção na melhoria de quatro domínios, em alunos entre o quarto e o sétimo ano letivo, através de questionários aplicados pré e pós-intervenções. Esses domínios são: proeminência (i.e., se as espécies são tidas em conta nos corações e mentes das pessoas), conhecimento, emoções e tolerância e compromisso (i.e., disposição para se comprometer com iniciativas de conservação). As diferenças entre as intervenções pretenderam refletir as diferenças entre educação formal e educação informal, estando a formal associada a uma aprendizagem passiva e a informal a uma maior flexibilidade e liberdade na construção de conhecimento. Uma das intervenções (I) foi semelhante a uma aula típica, onde era transmitido conhecimento factual aos alunos por meio de um método associado à aprendizagem passiva. A segunda intervenção (II) representou a aprendizagem ativa, porque os alunos obtiveram conhecimento subjetivo através da participação numa atividade de storytelling. Modelos mistos lineares generalizados e ordinais logísticos (GLMM e CLMM, respetivamente) foram usados para avaliar a influência de variáveis demográficas, socioeconómicas e de experiência pessoal em todos os domínios antes das intervenções; e analisar a comparação entre questionários pré e pós-intervenção. Os resultados mostraram que os alunos que passam mais tempo na Caatinga apresentaram maior proeminência, conhecimento e emoções e tolerância positivas - a proximidade com a natureza é referida em vários trabalhos como importante para o desenvolvimento do conhecimento e afetividade para com a natureza. Alunos que provêm de um contexto de menor nível socioeconómico apresentaram menor conhecimento e mais emoções e tolerância negativas - pessoas que tenham dificuldade em garantir as suas necessidades básicas de vida geralmente têm uma visão mais utilitarista da vida selvagem e podem ter falta de acesso a informação. Alunos cuja mãe tenha um maior nível de instrução demonstraram emoções e tolerância mais positivas – um maior nível de instrução dos pais está associado a uma maior importância dada à conservação da natureza pelos seus filhos. Os alunos mais velhos demonstraram um maior nível de compromisso – a interação com o meio que os rodeia desenvolve-se com a idade, e o seu aumento fomenta naturalmente um maior esclarecimento em relação à escolha de participação em iniciativas de conservação. Ambas asintervenções aumentaram significativamente a proeminência, o conhecimento e as emoções e tolerância positivas dos participantes em relação a jaguares e pumas. Aqueles que passaram pela intervenção I tiveram maior aumento de proeminência e emoções e tolerância positivas e os que passaram pela intervenção II demonstraram um maior aumento no conhecimento. O compromisso não apresentou mudanças estatisticamente significativas após as intervenções, mas, tendencialmente, a intervenção I teve um maior sucesso. Estas discrepâncias nos resultados, em relação ao que era esperado, podem ter sido consequência das diferenças no formato das intervenções. A I tinha uma componente visual mais forte, o que permitiu uma maior cativação dos alunos e que estes fizessem uma melhor distinção das duas espécies de felinos. A II demonstrou a maior eficácia do storytelling e educação informal na transmissão de conhecimento. A proeminência já era forte antes das intervenções, uma vez que que os jaguares e os pumas são os carnívoros mais presentes nas mentes dos habitantes do Boqueirão da Onça. Apesar de terem algum conhecimento prévio sobre a biologia e ecologia destas espécies, os estudantes mostraram dúvidas sobre alguns aspetos, como o sucesso na caça e a tendência populacional. No que toca a emoções e tolerância, conseguiram aceitar a existência e entender a importância dos felinos, porém, o medo não diminuiu significativamente. Houve também alguma confusão sobre a proteção da natureza e quem é responsável por ela. O compromisso não teve mudanças significativas após as intervenções, provavelmente por este método não ser o mais adequado para o desenvolver. Estes resultados evidenciam a necessidade de direcionar futuras intervenções para um melhor esclarecimento dos hábitos destas espécies. É também fundamental abordar o assunto de forma mais inclusiva: considerar ecossistemas inteiros, explicar o papel de cada parte interessada (individual ou coletiva) na conservação e integrar informação sobre aspetos políticos, sociais e possíveis percursos académicos e profissões relacionadas com a natureza. No geral, apesar dos efeitos do estudo se referirem apenas a um curto período de tempo após as intervenções, melhorias na proeminência, conhecimento e emoções e tolerância foram evidentes. Idealmente, a retenção a longo prazo deve ser testada, não tendo sido possível neste estudo. A falta de trabalhos com foco na educação e em jaguares e pumas realça a importância deste tipo de investigação. A maioria dos trabalhos apenas menciona educação como uma solução para conflitos entre humanos e animais selvagens. O foco dos trabalhos de educação no Brasil parece ser com primatas e não existe nenhum trabalho sistemático de educação para a conservação na Caatinga. Para além disso, não existe nenhum trabalho com menos de 20 anos que analise a comparação de métodos educativos e o seu respetivo sucesso. Assim, tendo em conta os resultados favoráveis do estudo, métodos mistos, com características tanto de educação formal como de informal, devem ser o caminho a seguir para maximizar o sucesso deste tipo de intervenções. Os investigadores devem adaptar iniciativas semelhantes aos contextos sociais locais, isto é, ter em conta as prioridades do público-alvo e as suas características socioeconómicas e demográficas, especialmente quando na presença de pessoas com dificuldades financeiras, para garantir um melhor e mais fácil acesso a informação. Por fim, devem também ter como objetivo a expansão da sua audiência e apostar na continuidade dos projetos para atingir um maior sucesso. Em conclusão, este estudo enfatiza a importância de abordagens mistas na educação para a conservação como forma de melhorar a coexistência entre humanos e animais selvagens.

U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary factor small subunit (U2AF(35)) is encoded by a conserved gene designated U2AF1. Here we provide evidence for the existence of alternative vertebrate transcripts encoding different U2AF(35) isoforms. Three mRNA isoforms (termed U2AF(35)a-c) were produced by alternative splicing of the human U2AF1 gene. U2AF(35)c contains a premature stop codon that targets the resulting mRNA to nonsense-mediated mRNA decay. U2AF(35)b differs from the previously described U2AF(35)a isoform in 7 amino acids located at the atypical RNA Recognition Motif involved in dimerization with U2AF(65). Biochemical experiments indicate that isoform U2AF(35)b, which has been highly conserved from fish to man, maintains the ability to interact with U2AF(65), stimulates U2AF(65) binding to a pre-mRNA, and promotes U2AF splicing activity in vitro. Real time, quantitative PCR analysis indicates that U2AF(35)a is the most abundant isoform expressed in murine tissues, although the ratio between U2AF(35)a and U2AF(35)b varies from 10-fold in the brain to 20-fold in skeletal muscle. We propose that post-transcriptional regulation of U2AF1 gene expression may provide a mechanism by which the relative cellular concentration and availability of U2AF(35) protein isoforms are modulated, thus contributing to the finely tuned control of splicing events in different tissues.

In cervical cells, the E6 protein of the oncogenic human papillomavirus (HPV) types inactivates p53, promoting its degradation. Consequently, mutations of the p53 gene are rarely seen in these cancers. Our recent data indicate that the cutaneous HPV38 is involved in skin carcinogenesis. In this study, we have determined the presence of HPV38 and the status of p53 gene in 32 non-melanoma skin cancers. We found that p53 gene is frequently mutated in HPV38-positive skin cancers and that HPV38 E6 does not promote p53 degradation. Thus, different mechanisms appear to be involved in the development of HPV-positive cervical and skin cancers.

Does street art & urban creativity contribute to settlement and establishment of places or non places? Do such artistic practices transform non places into places and/or vice-versa? Taking on a methodological research towards such questions this issue brings forward original research concerning these artistic practices in the contemporary background. Whether exploring street art & urban creativity in specific urban contexts or discussing its own rightful place, this issue sheds some light on such questions and contributes to the current scientific debate.

Espécies do género Candida fazem parte da microbiota do trato gastrointestinal humano, sendo capazes de colonizar também a pele e superfícies mucosas do corpo humano, como organismos comensais. No entanto são a causa mais comum de infeções por fungos oportunistas no mundo, causando candidíases superficiais e sistémicas. As candidíases sistémicas têm uma taxa de mortalidade altíssima, especialmente quando associadas a pacientes imunocomprometidos. A espécie do género Candida mais frequentemente isolada em pacientes com candidíase é Candida albicans, mas ao longo dos anos tem se observado um aumento na frequência de infeções causadas por outras espécies do género Candida. Entre elas, Candida glabrata tornou-se na segunda causa mais comum de candidíase em humanos, maioritariamente devido à sua capacidade de adquirir resistência aos antifúngicos. Em contraste com outras espécies do género Candida, C. glabrata é haploide, não produz hifas, e apesar de ter no seu genoma os genes necessários para a reprodução sexuada e meiose, reproduz-se exclusivamente de forma clonal. No entanto tem um elevado grau de diversidade clonal, devido a alterações cromossomais, aneuploidias, translocações e mesmo à ocorrência de perda de cromossomas. Curiosamente C. glabrata é filognéticamente mais próxima de S. cerevisiae do que de C. albicans ou de outras espécies do género Candida, o que permite fazer mais facilmente inferências sobre C. glabrata, com base em estudos feitos em S. cerevisiae. Os azóis são uma classe de antifúngicos que atuam na via de biossíntese do ergosterol, efetivamente impedindo a ação da enzima lanosterol 14 α-demetilase, codificada pelo gene ERG11, bloqueando a síntese de ergosterol dentro da célula. O ergosterol é um componente importante na membrana plasmática dos fungos, e ao impedir a sua síntese, os azóis levam à síntese de um esterol tóxico para o fungo, comprometendo a integridade da membrana e vários processos fisiológicos. Experiências anteriores de microevolução, foram feitas para desvendar os mecanismos através dos quais C. glabrata adquire resistência aos azóis. Através de sequenciação genómica, descobriu-se que uma estirpe evoluida para adquirir resistência a azóis, adquiriu uma mutação no gene PGD1 (CAGL0A01325g). Surpreendentemente, verificou-se que a deleção deste gene confere resistência a azóis em meio líquido, mas susceptibilidade a azóis em meio sólido. O foco principal deste estudo foi a investigação do papel do Pgd1 na modulação da resistência e suscetibilidade a azóis. O Pgd1 é uma subunidade da cauda do complexo Mediador da RNA polimerase II, complexo este que é essencial para a formação do “pre-initiation complex”, e, portanto, essencial para a transcrição no geral. O complexo Mediador é composto por proteínas que estão associadas em quatro grupos: a cabeça, o meio, a cauda e o complexo Cdk8 cinase. As proteínas da cabeça e do meio, são centrais para o recrutamento do complexo Mediador para os promotores, e deletar genes destes grupos torna-se letal para a célula. Já as proteínas da cauda e do complexo Cdk8 cinase, têm uma função mais regulatória na transcrição, e a sua deleção não compromete a viabilidade celular. Confirmou-se com recurso a uma proteína de fusão Gfp_Pgd1, que o Pgd1 está localizado de forma constitutiva no núcleo de células de C. glabrata, independentemente de estas terem sido expostas ou não a azóis. Para além disso, ao expressar o PGD1 a partir de um plasmídeo, verificou-se que há a complementação dos fenótipos exibidos pelo mutante Δpgd1, e que a sobre-expressão do PGD1 leva a aumento da suscetibilidade de C. glabrata a azóis em meio líquido. De modo a compreender o papel do Pgd1 na regulação global da transcrição, imposta pela exposição a azóis, uma estirpe selvagem (“wild type”) e um mutante de eliminação Δpgd1 foram crescidos em meio sólido ou líquido, na presença de uma concentração inibitória de fluconazol. Através da técnica de sequenciação de RNA, descobriu-se que a deleção do PGD1, na presença de fluconazol, afeta a expressão de 972 genes. Estes genes foram classificados manualmente quanto à sua função e relação com mecanismos de resistência a azóis, ou alterações na sua expressão em estirpes resistentes a azóis, recorrendo também a ferramentas computacionais como “GoToolBox” e o “Pathoyeastract”. Identificou-se que o Pgd1 controla a expressão de genes com várias funções diferentes dentro da célula, desde metabolismo de carbohidratos, adesão, reparação de DNA ou mesmo tráfico intracelular, incluindo até vários genes cuja função ainda é desconhecida em C. glabrata. Mas o mais relevante é que o Pgd1 controla genes relacionados com a biossíntese de ergosterol e metabolismo de lípidos, e também está envolvido na transcrição de genes envolvidos na resposta a drogas. De facto, o Pgd1, na presença de azóis, regula a transcrição de genes envolvidos nas vias afetadas por estes antifúngicos, biossíntese de ergosterol e metabolismo de lípidos, e de genes que podem ter alguma função na resposta a drogas, que confiram resistência ou pelo menos tolerância a antifúngicos Dado o efeito dual do Pgd1 em meio sólido e meio líquido, 36 genes foram selecionados para estudos adicionais, devido a terem regulação dual da sua expressão, consoante o meio ser líquido ou sólido. Nove desses genes são simultaneamente ativados pelo Pgd1 em meio sólido, e reprimidos em meio líquido, e os outros 27 são simultaneamente reprimidos pelo Pgd1 em meio sólido e ativados em meio líquido. No entanto só se conseguiu avaliar o efeito da deleção de 23 desses genes. Isto foi feito através de ensaios de suscetibilidade a drogas, nomeadamente através de ensaios de “spots”, em meio sólido, e de concentração mínima inibitória (CMI), em meio líquido, ambos para três antifúngicos da classe dos azóis: fluconazol, cetoconazol e posaconazol. Entre estes genes, apenas se confirmou o gene CDR1 como um determinante claro de resistência a azóis, o que é consistente com o seu papel como bomba de efluxo de azóis, sobre-expresso em estirpes resistentes a azóis, normalmente por causa de mutações de ganho de função no fator de transcrição Pdr1. Pelo que foi observado neste estudo, é possível que o impacto que o Pgd1 tem na expressão de CDR1 explique por si só o fenótipo dual observado no mutante Δpgd1. A expressão de CDR1 é maioritariamente controlada pelo fator de transcrição Pdr1, muito ligado a resistência aos azóis. Este fator de transcrição, após interação física com azóis, recruta a subunidade da cauda do complexo Mediador Gal11. Sabe-se também que ao eliminar por completo a proteína Pgd1, a capacidade de Gal11 se ligar ao resto do complexo, e de interagir com fatores de transcrição como Pdr1, fica afetada. Assim, o modelo que se propõe neste trabalho é que o Pgd1 seja necessário para a interação entre Pdr1-Gal11 e o resto das subunidades do complexo Mediador, controlando assim, através do Pdr1, a expressão do gene CDR1. Ainda assim continuamos com várias questões por explicar, nomeadamente em relação à atividade do Pgd1 como determinante de suscetibilidade a azóis em meio líquido. No futuro seria interessante estudar a interação do Pgd1 com as outras subunidades do complexo Mediador, ou até interações entre o Pgd1 e outros fatores de transcrição associados à resistência a azóis, tal como o Pdr1 e outros. Seria também interessante avaliar como as diferentes condições do meio ambiente afetam as interações que são estabelecidas entre fatores de transcrição e componentes da maquinaria transcricional. Seria também muito relevante avaliar a importância clínica dos dados obtidos neste estudo, incluindo a avaliação do eventual papel de mutações no PGD1 em isolados clínicos resistentes em comparação com isolados clínicos suscetíveis de C. glabrata.

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In the aftermath of the Lisbon Street Art & Urban Creativity International Conference (June 2015) the Executive Committee of the conference intends to promote and foster the existence of broader approaches to the conference's outcomes. The Street & Urban Creativity International Research Topic will develop actions to generate stronger articulations between researchers through collective applications, applied researches and publishing material.

In the aftermath of the Lisbon Street Art & Urban Creativity International Conference (June 2015) the Executive Committee of the conference intends to promote and foster the existence of broader approaches to the conference's outcomes. The Street & Urban Creativity International Research Topic will develop actions to generate stronger articulations between researchers through collective applications, applied research and publishing material.

A metabolómica é um campo emergente na biologia de sistemas que visa realizar uma análise global do metaboloma de um sistema biológico ao identificar e quantificar todos os seus metabolitos. Devido à alta diversidade na concentração, estrutura e caraterísticas químicas dos metabolitos, esta é uma tarefa complexa que requer a utilização de metodologias de alta resolução como espetrometria de massa (MS, Mass Spectrometry) ou ressonância magnética nuclear (NMR, Nuclear Magnetic Resonance). Apesar destes métodos não identificarem todos os metabolitos presentes num sistema (devido a limitações na gama dinâmica dos instrumentos utilizados e a preferência de cada abordagem para certos tipos de metabolitos), estes oferecem uma visão aproximada do metaboloma completo. A complexidade dos dados obtidos requerem primeiro um pré-processamento e depois um pré tratamento adequados para extrair a informação presente. Assim, ambas estas etapas são cruciais no fluxo normal de trabalho em metabolómica e, como tal, devem ser ponderados e escolhidos cuidadosamente. Sendo que muitos factores afectam significativamente o metaboloma de um sistema biológico, dados de metabolómica têm sido usados com sucesso na discriminação de amostras de diferentes sistemas e para a identificação de metabolitos chave que suportam esta discriminação, através de variados métodos estatísticos. O pré-processamento gera um conjunto de dados 2D com caraterísticas (normalmente picos m/z em análise MS) num eixo e amostras no outro. Na formação destes dados surgem valores em falta – amostras que não têm caraterísticas presentes noutras amostras. Sendo que diversos métodos estatísticos não suportam a existência de valores em falta, são aplicados métodos de filtração de picos para reduzir o número destes; seguidos da aplicação de um método de imputação dos valores em falta que restam após filtração. A análise de dados procede com a aplicação de pré-tratamentos que podem ser divididos em três sub-categorias – normalizações (incluído às vezes no pré-processamento), transformações e scaling. Uma combinação de métodos destas categorias é utilizado para extrair e destacar a variação biológica significativa entre as amostras. Contudo, todos estes métodos tradicionais destacam os padrões de intensidades entre as caraterísticas em detrimento de outras informações importantes no contexto da metabolómica como a presença e ausência destas nas amostras. Um possível problema desta utilização para a análise de dados de metabolómica é a intensidade ter uma variabilidade elevada mesmo entre amostras do mesmo grupo. Esta variabilidade aumenta ainda mais quando analisadas em lotes experimentais diferentes, instrumentos diferentes com preparação de amostras diferentes, métodos ou parâmetros de pré processamento diferentes, entre outros, originando uma baixa reprodutibilidade dos dados. A dificuldade da identificação estrutural inequívoca dos metabolitos chave na discriminação de grupos coloca-se como outro problema na análise de dados. O objetivo deste trabalho foi desenvolver duas novas abordagens para a análise computacional de dados de metabolómica, no contexto da caraterização e discriminação de amostras biológicas. Estes tratamentos descartam a informação de sinais da intensidade predominantemente utilizada pelos métodos de tratamento estabelecidos, de forma a evitar a elevada variabilidade desta, concentrando-se noutros aspectos dos dados, o que deve oferecer uma nova perspetiva sobre estes. Como parte deste desenvolvimento, uma avaliação sistemática da performance destes tratamentos para um set seleccionado de conjuntos de dados de MS de alta resolução foi outro objetivo principal do trabalho. Três combinações de métodos de pré-tratamento tradicionais foram comparadas na análise de resultados: 1) Pareto scaling; 2) Normalização por uma caraterística de referência e Pareto scaling; 3) Normalização, transformação logarítmica generalizada e Pareto scaling. Foram utilizados dois conjuntos de dados metabolómica de videira (Vitis) contendo 3 réplicas de 11 variedades cada – um obtido por electrospray em modo negativo de ionização (ESI- ) e outro em modo positivo de ionização (ESI+ ) – e um conjunto de dados de 3 réplicas de 5 estirpes de leveduras, utilizando ou a lista de picos m/z ou fórmulas atribuídas aos picos (quando possível) como caraterísticas. Semelhança binária (BinSim, Binary Similarity) é a primeira abordagem desenvolvida, sendo baseada no conceito de considerar exclusivamente a ocorrência de características espectrais. A ideia é que o conjunto de metabolitos identificados por métodos de alta resolução é caraterístico dos diferentes sistemas e pode ser utilizado para os discriminar, conseguindo obter resultados mais consistentes devido à menor variabilidade da identificação de metabolitos em relação à informação dos sinais de intensidade (descartada). Este método consiste na construção de um vector binário para cada amostra que codifica a presença de uma caraterística como 1 e ausência como 0 que pode ser usado para transformar os dados antes da aplicação de métodos estatísticos para caraterizar e classificar amostras. A simplicidade deste método encontra-se no facto de que necessita (e até prefere) pouca filtração de picos e de que salta a escolha dos métodos de imputação de valores em falta e combinação de normalizações, transformações e scaling a usar, acelerando a análise de dados. Utilizando métodos de agrupamento de amostras (não supervisionados) e modelos de classificação (supervisionados), a qualidade da discriminação das amostras nos seus respetivos grupos em dados transformados com BinSim foi consistentemente semelhante ou ligeiramente melhor do que quando tratados com tratamentos baseados em intensidade, levando, quase sempre, à melhor ou segunda melhor discriminação (dos 4 tratamentos comparados). Uma discriminação perfeita foi atingida nos dados da levedura em todos os métodos estatísticos usados; nos dados da videira, métodos não supervisionados agruparam corretamente cerca de metade dos grupos e os métodos de classificação supervisionados (Random Forest e Partial Least Squares - Discrimination Analysis, PLS-DA) previram com cerca de 80% de precisão os grupos das amostras. Para observar se esta discriminação era obtida por informação menos usada pelos métodos tradicionais, retirou-se os 2% de caraterísticas consideradas mais importantes para construir os modelos de classificação de Random Forest e de PLS-DA dos dados tratados das diferentes formas. Este conjunto de caraterísticas importantes nos dados tratados com o BinSim é muito distinto, tendo um grande número de caraterísticas apenas presentes neste (73,5% em média) em comparação com os conjuntos obtidos dos modelos construídos de dados tratados de forma diferente. Além disso, estas apareciam num pequeno número de grupos (em comparação com os restantes casos), ou seja, eram caraterísticas com muitos valores em falta e que, por isso, são muitas vezes filtradas. Nas caraterísticas importantes para construir modelos Random Forest nos dados da levedura, esta tendência foi mais acentuada com características importantes a aparecerem predominantemente apenas num grupo, ou seja, a atuarem como biomarcadores desse grupo nos dados estudados. Conclui-se, então, que a informação obtida por este tratamento é distinta em relação aos outros tratamentos baseados em intensidade no fluxo de trabalho da metabolómica. A segunda abordagem consiste em construir uma rede de diferença de massas (MDiN, Mass Difference Network) para cada amostra de um conjunto de dados e discriminar estas pela comparação das suas caraterísticas. MDiN foi um conceito originalmente desenvolvido por Breitling et al. que usa a lista de massas de dados de metabolómica como vértices/nós na rede e um conjunto de diferença de massas que estabelece arestas entre os vértices com diferenças que se enquadram nesse conjunto. Cada diferença de massa (MDB, Mass-Difference-based Building block) corresponde a uma diferença na fórmula elementar de um metabolito após a ocorrência de uma reação bioquímica comum (enzimática ou não enzimática). Assim, para cada amostra, forma-se uma rede semelhante, conceptualmente, às redes metabólicas mas gerada apenas pela informação do conjunto de dados. Cada rede tem a informação das possíveis transformações biologicamente significativas entre os metabolitos presentes que podem ocorrer num contexto biológico, enfatizando, a presença destas interações sobre a intensidade de cada caraterística. Apesar da complexidade, as redes construídas podem ser analisadas e comparadas de inúmeras formas diferentes, mostrando ter uma grande versatilidade no modo como podem ser usadas, sendo esta a principal vantagem do método. As redes construídas foram analisadas por diferentes métodos de análise de redes: focadas na centralidade dos nós (grau, intermediação e proximidade), ou nas caraterísticas globais das redes como no número de vezes que cada MDB foi usada para estabelecer arestas e na topologia da rede (usando o GCD-11, Graphlet Correlation Distance using 11 graphlet orbits). Comparando os resultados das análises por variados métodos estatísticos, a análise da centralidade dos nós, especificamente do grau, permitiu a melhor discriminação das amostras nos seus grupos. Resultados indicaram que a análise de cada nó pelas suas possíveis interações permite uma discriminação dos grupos semelhante à alcançada quando os dados são tratados com os tratamentos tradicionais mencionados anteriormente. Contudo, a análise das caraterísticas globais das redes deu indicações que poderá demonstrar diferenças importantes e biologicamente significativas gerais do metabolismo ao nível da proeminência de diferentes tipos de reações no sistema. Conclui-se, então, que ambas as abordagens são viáveis na análise de dados de metabolómica, extraindo informação que pode ser utilizada para discriminar as amostras dos conjuntos de dados. A sua diferente perspetiva também permite que sejam usados numa análise que complemente a de outros tratamentos. Ainda mais, como estes tratamentos enfatizam informação com menos variabilidade do que a intensidade, têm um grande potencial na análise de múltiplos conjuntos de dados obtidos com diferentes instrumentos, laboratórios, entre outras hipóteses dos mesmos grupos biológicos, abrindo portas para estudos futuros que se possam focar na viabilidade destas estratégias neste contexto.

A ostra portuguesa, Crassostrea angulata (Lamarck, 1819), era uma espécie economicamente importante na Europa até que uma doença viral quase extinguiu a espécie no final da década de 1960. Em Portugal, a poluição das águas e a apanha excessiva desta ostra contribuíram igualmente para o seu declínio. Esta espécie apresenta uma distribuição limitada, ocorrendo naturalmente em alguns estuários do centro de Portugal continental até Marrocos. O objetivo principal deste trabalho foi ajudar na preservação e produção em aquacultura desta espécie de bivalve, uma vez que em condições de aquacultura é possível ter um maior controlo nutricional na produção destes organismos. Para tal, amostras de plâncton natural dos estuários dos rios Sado e Mira foram analisadas em diferentes alturas do ano, de modo a avaliar a composição nutricional do meio natural e de modo a permitir um processo de conhecimento e mimetização do que ocorre no meio natural para a produção, em aquacultura, de C. angulata. Para avaliar a composição nutricional das ostras provenientes de diferentes locais (aquacultura e bancos naturais de ostra do estuário do rio Sado, e de bancos naturais do estuário do rio Mira) e para perceber o reflexo do alimento existente no meio ambiente na composição nutricional da ostra, o perfil de ácidos gordos e teor lipídico da ostra foi igualmente avaliado. Tal avaliação permitiu, assim, perceber o balanço entre o endógeno (na ostra) e o exógeno (no plâncton). Adicionalmente, para substituir duas microalgas (Chaetoceros calcitrans e T-ISO) usadas na aquacultura de C. angulata, três espécies de diatomáceas (uma diatomácea cêntrica incertae sedis – CD –, Skeletonema marinoi e Thalassiosira eccentrica) e uma espécie de haptófita (Emiliania huxleyi) indígenas à costa portuguesa foram avaliadas em condições piloto. A substituição por microalgas autóctones é importante pelo facto destas espécies, sendo componentes do fitoplâncton destas regiões, já fazerem parte da dieta natural da ostra, assim como por não existir risco de introdução de espécies não autóctones, o que não põe em risco a integridade das comunidades fitoplanctónica destas regiões. O crescimento das três diatomáceas referidas, assim como a sua composição lipídica, classes de lípidos e perfil de ácidos gordos nas fases exponencial e estacionária foi igualmente estudado em condições laboratoriais. Os resultados indicam que o perfil de ácidos gordos das amostras naturais de plâncton dos estuários de ambos os rios tiveram variações nas diferentes estações do ano, provavelmente devido à dinâmica das comunidades de fitoplâncton. Ácidos gordos saturados (SFA) foram o grupo de ácidos gordos com maior percentagem em todos os meses analisados, em ambos os estuários. Neste grupo, verificou-se os ácidos gordos mais abundantes eram 14:0 (ácido mirístico) e 16:0 (ácido palmítico), com alternância consoante a estação. A percentagem mais elevada de ácidos gordos polinsaturados (PUFA) foi observada em Fevereiro (estuário do rio Sado) e Maio (estuário do rio Mira). A composição de cada ácido gordo variou consoante o mês, no entanto, os ácidos gordos essenciais, ácido eicosapentaenóico (EPA, 20:53) e ácido docosahexaenóico (DHA, 22:63), foram dos PUFA os que estiveram sempre em maior quantidade, registando valores superiores nos meses de Fevereiro e Maio. As ostras analisadas das três origens não possuíam nenhuma diferença significativa em termos de lípidos totais, com níveis na ordem dos 10%. De um modo geral, ostras dos bancos naturais possuíam uma menor percentagem de fosfolípidos, esteróis e ácidos gordos livres, enquanto que a percentagem de triacilgliceróis (TAG) foi superior à das ostras de aquacultura. Isto pode indicar a necessidade de acumulação de reservas energéticas nos sistemas dinâmicos que são os bancos de ostras. Em termos de ácidos gordos, C. angulata terá utilizado diretamente SFA e acumulado PUFA provenientes da sua dieta em plâncton, sobretudo EPA e DHA, que são dois ácidos gordos fundamentais e com papéis importantes no metabolismo das ostras. No geral, o perfil de ácidos gordos das ostras das três localizações não mostrou diferenças, sendo os ácidos gordos mais abundantes o 16:0, EPA e DHA. A razão 3/6 foi superior à de outras espécies de bivalves, e demonstrou que estas ostras teriam um interessante valor nutricional do ponto de vista do consumidor, visto terem uma razão sempre superior a 5.00. A partir do estudo do crescimento das diatomáceas autóctones, observou-se que S. marinoi foi a diatomácea de crescimento mais rápido, com uma taxa de crescimento de 0.321 ± 0.037 dia-1 . A utilização de metodologias in vivo, como densidade ótica e análise de fluorescência, a par com cálculos de densidade celular permitiu concluir que estas são bons proxies da densidade celular. Assim, tornam o acompanhamento do crescimento das culturas mais prático e expedito, quando comparado ao cálculo da densidade celular. Observou-se que a taxa de crescimento influenciou negativamente o teor lipídico, verificando-se que S. marinoi registou o menor teor das três. A fase de crescimento também teve influência sobre a composição lipídica das três diatomáceas, tendo se observado que a composição de CD e T. eccentrica mais que duplicou na fase estacionária (atingindo valores superiores a 20 %), enquanto que S. marinoi se manteve semelhante registando valores semelhantes nas duas fases, na ordem dos 7%. TAG foram a principal classe de lípidos em ambas as fases de crescimento, e CD e S. marinoi acumularam estes lípidos na sua fase estacionária. A concentração média de todos os ácidos gordos diminuiu na fase estacionária de S. marinoi. CD e S. marinoi tiveram uma diminuição da composição de PUFA na fase estacionária, enquanto que em T. eccentrica este grupo de ácidos gordos aumentou na mesma fase de crescimento. O ácido palmítico foi o componente maioritário dos SFA, o ácido palmitoleico (16:17) foi o componente maioritário dos ácidos gordos monoinsaturados (MUFA), e o componente maioritário dos PUFA foi EPA, em ambas as fases de crescimento. A concentração média de EPA e DHA foi mais elevada durante a fase exponencial nas três diatomáceas, no caso do EPA esta diferença foi significativa para CD e S. marinoi. Da comparação de C. calcitrans com as três diatomáceas autóctones, crescidas em escala piloto e analisadas na mesma fase de crescimento, foi observado que nenhuma delas apresentava uma vantagem clara em termos do perfil de ácidos gordos face a C. aclcitrans. Skeletonema marinoi e T. eccentrica registaram uma concentração média de SFA e MUFA semelhante a C. calcitrans, enquanto que a concentração média de PUFA das três diatomáceas foi menor que a de C. calcitrans. Thalassiosira eccentrica teve uma concentração média de 16:0 e 16:17 mais elevada que C. calcitrans. A maior concentração de EPA foi registada por C. calcitrans. Por sua vez, CD teve a maior concentração de DHA. Com base nos resultados obtidos neste trabalho, seria necessário mais trabalho de investigação com dietas formuladas a partir destas diatomáceas, para perceber se a sua influência nos diferentes estados de crescimento de C. agulata é vantajosa, quando comparada com C. calcitrans. A concentração dos diferentes ácidos gordos de E. huxleyi não foi constante nas diferentes amostras analisadas e, por isso, a sua comparação com T-ISO não foi conclusiva. Compararam-se estas duas espécies por pertencerem à mesma classe (Prymnesiophyceae) e por serem ambas microalgas ricas em DHA, o que poderia tornar E. huxleyi uma espécie interessante para substituir T-ISO. A grande variabilidade de resultados reforça a necessidade de mais estudos de investigação para averiguar a possibilidade do uso desta haptófita autóctone em dietas usadas na produção de C. angulata.

Ulcerative colitis is an idiopathic chronic inflammatory bowel disease characterized by periods of remission and acute exacerbations, and unpredictable disease course. Despite the availability of new drugs, there are still a considerable proportion of patients that will be refractory to therapy, need colectomy or develop complications, highlighting the need for better predictive markers of disease course (Bryant et al. (2016)). Considering the endoscopic extent of the disease at the time of diagnosis, patients were divided into three major subgroups: inflammation limited to the rectum (E1), left-sided colitis with inflammation distally to the splenic flexure (E2) and extensive colitis with involvement proximal to the splenic flexure (E3). The combination of endoscopy and histology seems to provide a better indication of disease activity than endoscopy alone, especially in endoscopically non-inflamed mucosa. No study has assessed the prognostic value of histological features at diagnosis, and therefore it remains unknown whether the pre-treatment microscopic findings can predict the course of the disease. This research topic was proposed by two gastroenterology doctors (Catarina Frias Gomes under the guidance of Dr. Joana Torres), who developed the clinical part of the project, as well as the study protocol. This dissertation then made it possible to answer the questions posed, developing the statistical component (under the guidance of professor Dr. Marília Antunes). Herein, we designed a multicenter retrospective study to evaluate the prognostic value of histologic features in treatment-naïve proctitis and left-sided ulcerative colitis patients. The goals of this study were to evaluate the prevalence of microscopic inflammation in the macroscopically uninflamed mucosa, as well as the predictive value of the histological features of disease (in the endoscopically inflamed and non-inflamed mucosa) at the time of diagnosis. In Portugal there has been a considerable consumption of medical resources associated to UC. Between 2010 and 2017, around 3400 people were hospitalised due to this disease, with an average hospital stay of 10 days with a minimum of 0 days and a maximum of 109 days, making the study of hospitalisations due to this disease a very relevant issue in order to have a perspective of its occurrence, as well as to help in the monitoring of patients and in clinical and hospital administration decision making. In this work, we analyse the time to the need of hospitalisation of 93 patients diagnosed with UC in stages E1 and E2. Cox models were used since proportional hazards assumption was not rejected and Cox models are popular amongst medical researchers, especially concerning the parameter interpretation (Cox and Oakes (1984)). Moreover, according to (Nardi and Schemper (2003)), a good discrimination among parametric models require censoring not to exceed 40-50 per cent. Our data is of moderate size and about 85% of the cases correspond to censored times. Nevertheless, for comparison purposes, we consider fitting parametric models in future work since they can perform better than the Cox model if the required conditions are met. As said above, a large proportion of individuals had no hospitalisations despite their long disease history, suggesting that there are individuals who will never experience the event of interest, even if the time under observation could be prolonged indefinitely. Therefore, we considered the possible existence of “healed to hospitalisation” individuals. To explore this hypothesis, cure models were implemented considering the same set of covariates for comparison purposes (Cai et al. (2012)). It is assumed that the individuals come from a mixture of two populations – those who will experience a hospitalisation and those who will not. Besides producing an estimate of the probability of “cure”, it is expected to obtain a more realistic estimate of the survival function for the fraction of the population who will suffer the event. For the study of this outcome, all the 93 patients were considered, twelve of which had been hospitalized at some time and the remaining were considered censored. Variables age, extent of the disease to diagnosis, endoscopic severity to diagnosis, histological severity and involvement beyond the endoscopic margin were included as covariates. In the Cox model, only age was significant, with older individuals being expected to have later hospitalisations. After the study of the Cox models, and given the high percentage of censorships, the hypothesis that individuals who had not suffered the event until then would probably not suffer it even if the study was prolonged was raised. Thus, with interest in studying whether the censored individuals might be non susceptible to hospitalisations or whether they would suffer the event later, the idea of studying the cure models emerged. One of the main interests was to calculate what percentage of the population was non-susceptible, as well as to verify which variables could influence this choice. In the component defining the occurrence of cure, the only relevant variable was Nancy score, with higher level of Nancy score favouring susceptibility. None of the variables showed relevance to describe the failure time. Much can be improved as future work if one of the major limitations of this study, the sample size, is overcome. Due to the fact that the sample is small and the events of interest are infrequent, the results obtained throughout the study were not statistically significant and therefore could not be used to draw conclusions for clinical purposes nor to advise medical teams. However, since this is an exploratory study and as it is the first study in this area, the conclusions that are drawn (for example, which variables are good predictors for the occurrence of outcomes) can be used as a good indicator and starting point for future research.

Saccharomyces cerevisae é um organismo modelo com cerca de 6000 genes. A maior parte destes genes podem ser eliminados sem comprometer a viabilidade da levedura, sendo uma vasta fração destas mutações silenciosas, não produzindo um fenótipo aparente observável. Mudanças fenotípicas associadas a muitas mutações podem apenas ser observadas com o crescimento em certos meios de cultura ou sob determinadas condições de stress. No entanto, variações significativas ocorrem no metabolismo intracelular das células mutadas, particularmente se estas mutações estiverem associadas a vias metabólicas chave. Os estudos destas variações normalmente envolvem a caracterização de atividades enzimáticas ou a quantificação de um pequeno número de metabolitos para obter uma pequena fração do metabolismo específico de uma estirpe mutante. O desenvolvimento de plataformas analíticas que permitem a análise de perfis de metabolitos em grande escala, particularmente baseadas em espectrometria de massa, tem contribuído para uma caracterização mais completa do metaboloma de um organismo. A utilização de instrumentos de extrema resolução, tais como o espectrómetro de massa de ressonância ciclotrónica de ião com transformada de Fourier (FT-ICR, Fourier-transform ion cyclotron resonance), permite a deteção de milhares a dezenas de milhares de compostos e os mais recentes permitem até resolver a estrutura isotópica fina molecular, sendo particularmente relevantes na análise discriminatória de compostos com base em perfis químicos complexos. Neste trabalho foi seguida uma abordagem de metabolómica global (também denominada untargeted) baseada em FT-ICR-MS para o estudo do impacto de deleções de um só gene em leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae. Para este efeito, cinco estirpes isogénicas desta espécie foram analisadas. Além da estirpe de referência, foram analisadas três estirpes mutantes com deleção de um gene relacionadas com o catabolismo do metilglioxal, um composto dicarbonilo, muito reativo e citotóxico implicado em diversas condições patológicas. Duas destas estirpes mutantes apresentavam deleções nos genes GLO1 e GLO2, que codificam para os dois enzimas do sistema dos glioxalases, respetivamente o glioxalase I e o glioxalase II. Este sistema catalisa a degradação do metilglioxal de uma forma dependente do glutationo. A terceira estirpe relacionada com o catabolismo do metilglioxal, apresentava uma deleção no gene GRE3, que codifica para o enzima aldose redutase da levedura, o principal atuante num processo alternativo de eliminação do metilglioxal que não depende do glutationo. Finalmente, uma outra estirpe, deficiente no gene ENO1, que codifica para o enzima enolase 1, relacionado com a glicólise, foi também analisada como controlo. As estirpes foram crescidas em iguais condições, tendo sido analisado o seu crescimento a 600nm e posteriormente o seu metaboloma por FT-ICR-MS. Não foi observada alteração de fenótipo de crescimento, tendo as cinco estirpes apresentado curvas de crescimento extremamente semelhantes, atingindo todas a fase estacionária de crescimento ao fim de 10 a 12 horas. A extração dos metabolitos de todas as estirpes, em fase estacionária de crescimento, foi efetuada utilizando uma mistura de metanol/água (1:1) e os diferentes extratos foram de seguida analisados por FT-ICR-MS em modo positivo de ionização por electrospray. As listas de picos dos espectros obtidos foram depois alinhadas e utilizadas para a identificação dos metabolitos, utilizando bases de dados metabolómicas humana e de levedura, e para a obtenção das fórmulas de composição elementar, previstas com base numa série de regras heurísticas. Realizaram-se depois contagens do número de metabolitos em cada amostra e em cada estirpe, e contruiu-se um diagrama de Venn com a distribuição dos números de metabolitos comuns e exclusivos para cada estirpe. Analisaram-se ainda as naturezas químicas das moléculas em cada estirpe, para as quais tinha sido possível prever uma fórmula química, construindo-se diagramas de Van Krevelen e um gráfico de séries de composição química. Três métodos de análise estatística multivariada foram aplicados aos dados de metabolómica. Estes foram a análise de componentes principais (PCA – principal component analysis), a análise de agrupamento hierárquico aglomerativo (HCA- hieararchical clustering analysis) e a análise discriminatória por regressão de mínimos quadrados parciais (PLS-DA – partial least squares discriminant analysis). Os primeiros dois são métodos não-supervisionados, o que significa que não é considerada a existência de grupos previamente definidos pelos quais as amostras se distribuem (neste caso as estirpes). Isto permite-lhes fazer uma separação das amostras com base numa medida global de semelhança entre elas, assegurando que os resultados refletem o perfil químico das amostras. Já o terceiro, PLS-DA, é um método supervisionado que pretende maximizar a covariância entre grupos previamente definidos. Isto leva a uma separação que pode não refletir necessariamente as maiores diferenças entre as amostras, visto que é dada uma maior importância a algumas variáveis (metabolitos) de modo a permitir uma melhor separação entre os grupos pré-definidos (estirpe), independentemente de esses grupos corresponderem ou não à melhor forma de separar as amostras. No entanto, o PLS-DA é útil pois permite a identificação das variáveis que mais contribuem para a separação. Neste trabalho, os dois métodos não supervisionados (PCA e HCA) demonstraram que era possível distinguir as estirpes com base nos seus perfis metabólicos, visto que amostras pertencentes à mesma estirpe apresentaram consistentemente um maior grau de semelhança metabólica entre elas do que com amostras pertencentes a estirpes diferentes. Além disso, revelaram-se também a existência de semelhanças entre as duas estirpes mutantes relacionadas com o sistema dos glioxalases (GLO1 e GLO2). A aplicação do método PLS-DA, supervisionado, permitiu maximizar a separação entre as estirpes, o que se revelou extremamente semelhante às separações realizadas pelos dois métodos não supervisionados. Esta concordância indica que a principal causa para as diferenças metabólicas entre as diferentes amostras se relaciona com a diferença de um só gene entre as estirpes, uma vez que a maximização da variância entre todas as amostras produz resultados semelhantes à maximização da covariância entre as estirpes. Através da análise das pontuações de importância da variável na projeção (VIP scores – variable importances on projection scores) calculadas para a separação por PLS-DA, identificaram-se os metabolitos que mais contribuíram para a separação, tendo o glutationo (GSH) emergido como o composto de maior importância, seguido de vários outros que apresentam, na generalidade, uma distribuição de abundâncias relativas semelhante. A asserção da importância do glutationo está em concordância com os níveis de semelhança metabólica verificados pelos métodos de análise estatística não-supervisionados. O glutationo apresenta uma menor abundância relativa nas estirpes com deleções em genes que codificam para os enzimas do sistema dos glioxalases, visto estes enzimas serem essenciais para a regeneração dos níveis desta molécula. Assim sendo, e tendo em consideração a identificação do glutationo como o composto mais importante para a separação por PLS-DA, a qual é extremamente semelhante às separações pelos métodos não supervisionados, é possível teorizar que as semelhanças verificadas entre as estirpes relacionadas com o sistema dos glioxilases são em larga parte devidas ao impacto da diminuição dos níveis de glutationo nas células. Com esta abordagem de metabolómica untargeted baseada em FT-ICR-MS, foi possível distinguir entre cinco estirpes de levedura que diferiam umas das outras em apenas um gene e que não apresentavam quaisquer diferenças fenotípicas observáveis quando crescidas em condições normais.

The intangible dimensions of the conservation of graffiti and street art were regarded by most to have a broader capacity for dealing with graffiti and street art as heritage, albeit mainly through documentation. Although physical conservation was regarded by some as a ‘non-issue’ this is, in fact, conceptually where we may find the greatest contemporary challenges – in response to which a range of possible solutions is suggested, such as self-preservation by the creator’s communities.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) is a widely used tool for estimating mobility parameters of fluorescently tagged molecules in cells. Despite the widespread use of confocal laser scanning microscopes (CLSMs) to perform photobleaching experiments, quantitative data analysis has been limited by lack of appropriate practical models. Here, we present a new approximate FRAP model for use on any standard CLSM. The main novelty of the method is that it takes into account diffusion of highly mobile molecules during the bleach phase. In fact, we show that by the time the first postbleach image is acquired in a CLSM a significant fluorescence recovery of fast-moving molecules has already taken place. The model was tested by generating simulated FRAP recovery curves for a wide range of diffusion coefficients and immobile fractions. The method was further validated by an experimental determination of the diffusion coefficient of fluorescent dextrans and green fluorescent protein. The new FRAP method was used to compare the mobility rates of fluorescent dextrans of 20, 40, 70, and 500 kDa in aqueous solution and in the nucleus of living HeLa cells. Diffusion coefficients were lower in the nucleoplasm, particularly for higher molecular weight dextrans. This is most likely caused by a sterical hindrance effect imposed by nuclear components. Decreasing the temperature from 37 to 22 degrees C reduces the dextran diffusion rates by approximately 30% in aqueous solution but has little effect on mobility in the nucleoplasm. This suggests that spatial constraints to diffusion of dextrans inside the nucleus are insensitive to temperature.