Repositório RCAAP

Os rotavírus são um dos principais agentes causadores de doenças entéricas em várias espécies animais, com ocorrência generalizada na suinocultura do Brasil. O seu diagnóstico é um componente essencial para estudos epidemiológicos e delimitação de medidas profiláticas visando o controle da doença. Apesar da relevância, não existem testes, tais como PCR em tempo real desenvolvido para detectar a diversidade genética de rotavírus suíno do grupo A (RVA). Este trabalho descreve o desenvolvimento de uma PCR em tempo real com SYBR® Green, para a detecção de rotavírus suíno e os seus resultados comparados com a PCR convencional e ELISA. Foram desenhados primers visando o segmento codificador da proteína NSP5 (137pb) e também foram utilizados primers visando o mRNA do gene mitocondrial bovino NADH5 (191pb) para o controle interno exógeno. Amostras de fezes de suínos de até 60 dias de idade de suínos do estado de São Paulo foram usadas para compor um painel de teste. Foram utilizadas como amostras de referencia o isolado 32/00 (controle positivo de rotavírus suíno do grupo A), concentrado de células MDBK (controle positivo do controle interno exógeno) e água tratada com DEPC (controle negativo). A extração do RNA total foi realizado com Trizol a partir de suspensões fecais contendo MDBK e o cDNA foi sintetizado utilizando primers aleatórios e M-MLV. Para as reações de PCR em tempo real utilizou-se o reagente MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas Life Science). Durante a padronização da PCR convencional, a temperatura de 54°C foi definida como a Tm ótima para a reação. O desempenho do ensaio foi validado em sete amostras positivas inicialmente testadas pelos métodos ELISA e PAGE. O isolado viral RV8209 foi utilizado para determinar o limiar de detecção da PCR em tempo real através de diluições seriadas sendo defino como ponto de corte Ct=33,5 (10-12,28TCID50%). O segmento codificador da NSP5 foi clonado no vetor pTZ57R/T submetido a restrição enzimática e usado como alvo para gerar uma curva padrão, onde obteve-se uma eficiência de 93,39%, slope de -3,49 e R2 de 0,993. A detecção do controle interno exógeno mostrou 82,9% de positividade para PCR convencional e 76,31% para a PCR em tempo real, com correlação significativa (0,718). O ensaio de ELISA para RVA apresentou 10,5% (8/78) de positividade, enquanto que as taxas de detecção da PCR em tempo real e PCR convencional foram de 50% (29/58) e 30,1% (24/63), respectivamente. Foi encontrada uma correlação moderada (0,546) entre PCR convencional e PCR em tempo real; baixa (0,056) entre a PCR convencional e ELISA; ausente (0,0) entre a PCR em tempo real e ELISA. Os resultados obtidos sugerem que a detecção por PCR em tempo real para a detecção do rotavírus suíno do grupo A em amostras fecais possa ser utilizada como diagnostico rápido e eficiente aumentando o repertório dos testes já estabelecidos, de modo a proporcionar uma maior sensibilidade para o diagnóstico clínico e epidemiológico.

A mastite subclínica em caprinos é causada principalmente pelo Staphylococcus spp., sendo os estafilococos coagulase negativa (SCN) os patógenos de maior ocorrência e o S. aureus, a espécie de estafilococos mais pesquisada. Dessa forma, pouco se conhece sobre a patogenicidade de SCN e outros estafilococos coagulase positiva (SCP), além do S. aureus. Também há poucos estudos sobre a variação da viabilidade celular na mastite subclínica de cabras. Assim, o objetivo do presente estudo foi determinar os fatores de virulência de adesão e produção de biofilme de estirpes de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de leite de cabras, verificando possíveis associações com a viabilidade celular. Para realizar a colheita das amostras, primeiramente, foi efetuada um exame físico da glândula mamária, com posterior realização dos testes da caneca de fundo preto e California mastitis test (CMT). A colheita do leite foi efetuada em três alíquotas: análises microbiológicas, contagem de células somáticas (CCS) e viabilidade celular. Realizou-se a identificação, teste de antibiograma e PCR (Reação em cadeia polimerase) dos Staphylococcus spp. isolados nas amostras de leite. Os genes de virulência pesquisados no PCR foram: cna, eno, ebpS, fnbA, fnbB, fib e bap. Avaliou-se a quantidade de CCS, em equipamento de citometria de fluxo, e a viabilidade celular, após centrifugações das amostras de leite e visualização das células em microscópio, utilizando o corante azul de Trypan. Os resultados foram: 122 amostras com crescimento bacteriano e dessas, 110 (90,2%) foram identificadas como Staphylococcus spp., sendo 90 (73,8%) de SCN e 12 (16,4%) de SCP. As espécies mais isoladas de estafilococos foram: S. epidermidis (24,55%), S. lugdunensis (15,40%) e S. intermedius (13,64%). As amostras apresentaram maior resistência aos antimicrobianos: penicilina (81,8%), oxacilina (60,0%) e ampicilina (55,5%). Observou-se maior sensibilidade para: enrofloxacina (99,1%), eritromicina (98,2%), gentamicina (98,2%) e vancomicina (98,2%). Com relação aos fatores de virulência pesquisados, foram encontradas amostras positivas para todos os genes, com exceção do gene fnbB: eno (53,6%), bap (43,7%), ebpS (19,1%), fnbA (18,2%) e fib (16,4%). Mais de um gene foi detectado em algumas estirpes, sendo que as associações de maior ocorrência foram: bap/eno em SCN e ebpS/eno/fib/fnbA em SCP. Os valores da CCS das amostras de leite com isolamento de Staphylococcus spp., SCN e SCP foram maiores do que nas amostras sem isolamento bacteriano e as estirpes com presença da associação de genes ebpS/eno/fib/fnbA apresentaram maior CCS do que bap/eno. Com relação à viabilidade celular, as amostras com isolamento de Staphylococcus spp. apresentaram maior viabilidade celular do que as amostras sem isolamento bacteriano e não houve associação dos genes identificados nas estirpes com a viabilidade celular. Concluiu-se que os genes eno e bap apresentaram maior ocorrência nas estirpes de Staphylococcus spp., sendo os mais encontrados nos isolados de SCN e os genes ebpS, fib e fnbA foram os mais detectados nos SCP. A viabilidade celular foi maior nas amostras com isolamento de Staphylococcus spp. em relação as sem isolamento bacteriano e não houve associação entre os fatores de virulência das estirpes de Staphylococcus spp. e a viabilidade celular.

Foram utilizadas 750 poedeiras comerciais de linhagens brancas com 23 semanas ao início do período experimental, distribuídas num delineamento em blocos completos aleatorizados sendo estes caracterizados pela oncatenação das linhagens com coluna de gaiolas; os tratamentos foram cinco densidades ou taxas de lotação na gaiola (321,43; 375; 450; 562,50 e 750 cm2/ave) com seis repetições, totalizando 150 parcelas experimentais. As dietas experimentais foram à base de milho e farelo de soja, formuladas para suprir as exigências nutricionais das linhagens em todas as fases. O desempenho produtivo e econômico foram avaliados através do peso dos ovos (g), percentagem de postura (%), massa de ovos (g/ave/dia), consumo de ração (g/ave/dia), conversão alimentar por dúzia (kg/dz) e por quilo de ovo (kg/kg). A qualidade de ovos foi avaliada através da gravidade específica (GE), unidades Haugh (UH), percentagens de gema, albúmen e casca, espessura da casca (EC), resistência à quebra (RQ), coloração da gema e índice gema (IG). O bem-estar das aves foi avaliado através de indicadores clínicos, imunológicos e fisiológicos. Para efeito da avaliação dos resultados, foram estabelecidos seis blocos com repetições internas. Os dados foram analisados com auxílio do SAS, sob modelo misto, considerando os efeitos da densidade, período e a interação entre estes, como fixos, além dos efeitos aleatórios de bloco e resíduo. Por se tratar de medidas repetidas longitudinalmente, buscou-se a melhor estrutura de covariância para cada variável. Quando adequado foi aplicado o teste de tukey-kramer para a comparação de médias (p<0,05). O menor consumo de ração, CA/dz de ovos e melhor desempenho econômico, foram obtidos pela densidade 321,4 cm2/ave. Altas densidades de alojamento não influenciaram a qualidade interna de ovos, a % casca e RQ, mas essas variáveis tiveram efeitos dos períodos, com os melhores valores nos primeiros períodos. Altas densidades tiveram efeitos negativos sobre a GE e EC, principalmente no pico de postura das aves. Os ovos avaliados encontravam-se dentro dos valores desejados, mesmo nas maiores densidades, podendo ser classificados como de excelente qualidade. A densidade de alojamento não interferiru (p>0,05) na avaliação clínica das aves, mas o maior espaço proporcionado nas gaiolas do sistema covencional conferiu menor freqüência de lesões nas aves, indicando promoção e melhora ao seu bem-estar geral. Dados de freqüência cardíaca e temperatura da cloaca estavam dentro dos padrões de normalidade para a espécie. Não foram observadas diferenças (p>0,05) das densidades na resposta imunológica das aves, com os títulos dos anticorpos vacinais contra as doenças de Gumboro e Newcastle acima dos níveis do ponto de corte (cutoff). Os tratamentos não modificaram o perfil sanguíneo das aves e não foi possível caracterizar um padrão de corticosterona no plasma e de excreção de metabólitos fecais de glicocorticoides. A técnica de enzimoimunoensaio, empregada utilizando anticorpo primário contra corticosterona e anticorpo secundário anticoelho de cabra, foi capaz de detectar as variações nas concentrações de corticosterona nesses tecidos, contudo, o entendimento do significado desses achados ainda necessita de novas investigações.

O cenário Brasileiro é propício para a ocorrência de casos humanos de tuberculose zoonótica, já que a tuberculose bovina ocorre em todo o território e há um importante mercado de queijos produzidos com leite cru, como o queijo minas artesanal. Assim, propôs-se um modelo quantitativo para estimar a probabilidade do produtor artesanal de queijo minas produzir o queijo contaminado com Mycobacterium bovis, se a unidade produtora possuir animais infectados. A fonte dos dados de entrada no modelo (representados por distribuições probabilísticas, sempre que possível) foram: legislação, livros, artigos científicos obtidos por revisão sistemática nas bases de dados (Scopus, Abstract, Scielo, PubMed, Science Direct and Web of Science). Características de produção de uma propriedade foram estabelecidas para compor o contexto do modelo. A simulação de Monte Carlo foi empregada para integrar os dados e avaliar o risco de propriedades-tipo ter pelo menos uma vaca produzindo leite contaminado com M. bovis. Adicionalmente, admitindo que esse leite contaminado (e sem prévia pasteurização) seja utilizado na fabricação de queijo tipo minas meia cura, foi calculada a menor porção de queijo contaminada com uma dose infectante, em cinco cenários, variando o número de animais doentes e eliminando o M. bovis. no leite, a carga de M. bovis. eliminada no leite e a dose infectante. Nas condições do estudo, a probabilidade da propriedade produzir leite contaminado pelo agente foi de 5,8% e a porção mínima de queijo que conteria a dose infectante de M. bovis. variou, de miligramas a quilos, nos cenários delineados, sugerindo que o risco à saúde pública pode ser significativo. Esses resultados evidenciam a necessidade de estudos que caracterizem as propriedades que fabricam este queijo no Estado e, para que a inferência do risco possa ser mais precisa, a ciência deverá prover dados que reduzam as incertezas de alguns parâmetros do modelo.\"

O bioma Amazônia possui uma vasta dimensão territorial e grande abundância e diversidade de espécies e habitats, contudo pouco se sabe sobre a epidemiologia das doenças que acometem os animais silvestres, em especial os que possuem carrapatos como vetores. O presente estudo teve por objetivo fazer o levantamento epidemiológico dos agentes transmitidos por carrapatos (Rickettsia, Ehrlichia, Anaplasma, Hepatozoon, Babesia, Coxiella e Borrelia) e tripanossomatídeos (Trypanosoma e Leishmania) em animais silvestres dos estados do Mato Grosso (MT) e Pará (PA), de fevereiro de 2009 a junho de 2012, incluindo-se mamíferos, aves e répteis. Foram coletadas amostras de tecidos e carrapatos de 181 animais silvestres, sendo 49 do Mato Grosso e 132 do Pará, e estas foram submetidas à extração de DNA, PCR e sequenciamento dos produtos amplificados. Todas as amostras de tecido foram negativas para Borrelia, Coxiella, Rickettsia e Trypanosomatidae. No Mato Grosso, das 49 amostras, 5 (10,2%) foram positivas para o gênero Hepatozoon, 5 (10,2%) para ordem Piroplasmida, 4 (8,2%) para Anaplasma e 1 (2,0%) para Ehrlichia. No Pará, das 132 amostras testadas, 2 (1,5%) foram positivas para Hepatozoon, 11 (8,3%) para Piroplasmida, 13 (9,8% para Anaplasma e 3 (2,3%) para Ehrlichia. Do total de 232 carrapatos do estado do Mato Grosso testados pela PCR, 139 (59,9%) foram positivos. Dentre os 117 carrapatos procedentes do Pará, 27 (23,1%) foram positivos. As amostras foram sequenciadas, sendo detectadas Rickettsia amblyommii, Rickettsia rhipicephali e Rickettsia monteiroi-like, nas espécies Amblyomma cajennense, Haemaphysalis juxtakochi e Amblyomma naponense, respectivamente, no Mato Grosso, R. amblyommii em Amblyomma longirostre e Amblyomma humerale, Rickettsia bellii em A. humerale e A. naponense, Rickettsia felis em A. humerale e Rickettsia c. f. africae em A. naponense. No presente trabalho foram detectados patógenos dos gêneros Rickettsia e Hepatozoon, membros da família Anaplasmataceae e da ordem Piroplasmida em espécies animais e regiões ainda não estudadas, revelando o enorme potencial para pesquisas aplicadas a animais silvestres da fauna Amazônica, cuja literatura ainda é bastante escassa em relação à ocorrência de patógenos, bem como a interação parasita hospedeiro.

Foi avaliado o desempenho de vacina de subunidade e bactéria completa antileptospirose em matrizes suínas analisando-se os níveis de anticorpos aglutinantes e neutralizantes. A intensidade e duração da imunidade passiva nos leitões, e ativa nas matrizes suínas foi investigada pela soroaglutinação microscópica (SAM) e teste de inibição de crescimento de leptospiras (ICL) em grupos de animais tratados com vacina experimental de subunidade e leptospira completa produzida com a mesma estirpe e com duas bacterinas comerciais. O experimento foi realizado em duas fases, na primeira, sendo utilizadas 33 matrizes. Os animais foram divididos em três grupos: grupo 1 (n=11):controle; grupo 2 (n=11): recebeu duas doses, em intervalo de 30 dias, de vacina anti-leptospirose constituída da subunidade de lipopolissacarídeo (LPS) de leptospira sorovar Canicola. Grupo 3 (n=11): recebeu duas doses, em intervalo de 30 dias, de uma bacterina de bactérias completas antileptospirose. Na segunda fase foram utilizadas 24 matrizes. Os animais foram divididos em três grupos: Grupo A (n=08): recebeu duas doses, em intervalo de 30 dias, de bacterina comercial anti-leptospirose A. Grupo B (n=08): recebeu duas doses, em intervalo de 30 dias, de bacterina comercial antileptospirose B e Grupo C (n=08): controle. Tanto na primeira fase como na segunda, foram realizados exames de SAM e de ICL nas matrizes e nos seus leitões, a fim de se avaliar títulos de aglutininas e de anticorpos neutralizantes obtidos respectivamente com a imunidade ativa e passiva. Os resultados das comparações dos títulos de anticorpos aglutinantes dos grupos tratados, 2 e 3, na primeira fase, apresentaram diferença aos 32 e 68 dias pós-vacinação. Não houve diferença para os anticorpos neutralizantes. No 30º dia de vida não foram detectados anticorpos aglutinantes nos leitões das matrizes vacinadas com LPS, e para anticorpos neutralizantes, os títulos médios foram de 0,832 no grupo 2 e 0,930 no grupo 3. Os títulos de anticorpos aglutinantes dos grupos A e B, na segunda fase, apresentaram diferença entre os sorovares das bacterinas comerciais, aos 60, 90 e 120 dias pós-vacinação. Aos 60 dias, houve diferença para o sorovares Copenhageni e Icterohaemorrhagiae. Em relação aos níveis de anticorpos neutralizantes das matrizes para o sorovar Hardjo, houve persistência de títulos de anticorpos neutralizantes nas sete avaliações realizadas nas duas bacterinas comerciais empregadas, e, em títulos baixos. Nos leitões foi constatada a transferência da imunidade colostral, somente com a bacterina comercial B confirmada pela presença de anticorpos aglutinantes, aos três e oito dias de vida. A vacina de LPS de bactéria completa apresentou perspectivas para emprego na prevenção da leptospirose suína. Houve diferença e baixa resposta imunológica nas bacterinas comerciais A e B anti-leptospirose, principalmente, para os sorovares Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae e Pomona, Copenhageni para a bacterina comercial B. A imunidade passiva, medida por anticorpos aglutinantes conferida pelas bacterinas comerciais A e B, foi de curta duração.

O presente trabalho objetivou avaliar o efeito da gordura do leite bovino na resistência térmica do Mycobacterium fortuitum. Amostras de leite bovino integral e desnatado foram contaminadas com inóculo padronizado de M. fortuitum, atingindo a concentração de aproximadamente 107 UFC/mL de leite, e submetidas à pasteurização lenta (65ºC/30mim.). Foi realizada a contagem do agente nos tempos 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos de pasteurização (em meio Lowenstein-Jensen, incubação a 37ºC/5 dias), e os resultados, em logarítmo, foram plotados em diagrama de dispersão com posterior regressão linear para construção da curva de sobreviventes (ou curva de morte térmica). Foram obtidas 3 curvas para o leite integral e 3 para o leite desnatado, porém, para o cálculo do valor D65ºC, utilizou-se a melhor reta obtida para cada tipo de leite. Encontraram-se valores D65ºC do Mycobacterium fortuitum iguais a 18,02 minutos para o leite integral e 7,82 minutos para o desnatado; a gordura do leite influenciou no padrão da curva de morte térmica e teve efeito protetor sobre o M. fortuitum. Conclui-se que a pasteurização lenta é capaz de reduzir 3,85 log de M. fortuitum em leite desnatado e 1,67 log em leite integral, resultando em diferentes níveis de segurança ao consumidor.

O presente trabalho teve como objetivo a análise microbiológica das amostras de leite de fêmeas bubalinas, a avaliação da quantidade de UFC/mL dos microrganismos isolados e a contagem de células somáticas/mL. Os quartos mamários foram submetidos ao teste de tamis e CMT e foram colhidas 262 amostras de leite de fêmeas bubalinas primíparas e pluríparas; para análise microbiológica, quantificação das UFC/mL e contagem de células somáticas/mL. A contagem das células somáticas foi realizada através da leitura em microscopia ótica dos esfregaços de leite. A leitura foi realizada utilizando-se a totalidade dos campos existentes no esfregaço de 1cm2. No teste do tamis, 99,6% das amostras apresentaram resultado negativo. No CMT, observamos resultado negativo em 88,2% das amostras; traços (8%), positivo 1+ (1,5%); positivo 2+ (1,15%); positivo 3+ (1,15%). A análise microbiológica apresentou amostras sem crescimento de microrganismos (75,6%); isolamento de Staphylococcus spp. (11,8%); Corynebacterium spp. (7,3%); Streptococcus spp, (3,1%) e crescimento de microrganismos associados (1,2%). A contagem total de células somáticas das amostras avaliadas apresentou mediana de 2300 células/mL de leite; a mediana da contagem de PMN e MN foi, respectivamente, 700 células/mL e 1500 células/ml de leite, com diferença estatisticamente significante (P<0,0001). As quantidades totais de células somáticas/mL e as quantidades de células polimorfonucleares e mononucleares nas amostras negativas ao exame microbiológico foram estatisticamente menores do que nas amostras que apresentaram isolamento de microrganismos. A mediana relativa às quantidade de UFC/mL foi de 550 UFC/mL para as amostras com isolamento de Corynebacterium spp.; 500 UFC/mL para as amostras com isolamento de Staphylococcus spp e 1100 UFC/mL para Streptococcus spp. ,sendo que não houve diferença estatisticamente significativa entre eles. Concluiu-se que a espécie bubalina, apresenta baixos índices de mastite; nas amostras com isolamento de microrganismos, o número de UFC/mL é pequeno.Existe um número de animais que apresenta resultado positivo no exame microbiológico do leite, sem contudo apresentar sinais de processo inflamatório.

Listeria monocytogenes e Yersinia enterocolitica são agentes zoonóticos e têm capacidade de transmissão através dos alimentos, inclusive carne suína. O presente estudo avaliou, mensalmente, de maio de 2007 a abril de 2008, alguns pontos da cadeia produtiva da carne suína em abatedouros e açougues do Estado de São Paulo. Foram avaliados ambientes dos estabelecimentos visitados e amostras de línguas, tonsilas e cortes de carne suína. Listeria monocytogenes foi isolada de todos os tipos de amostra, com presença dos sorotipos 4b, 1/2b, 1/2a e 1/2c. Estes isolados demonstraram grande similaridade, sugerindo até que haja persistência do agente em ambiente, de acordo com a PFGE, reforçando seu potencial de transmissão para humanos. Yersinia enterocolitica 4/ O:3 foi detectada exclusivamente em abatedouros, principalmente nos animais, apresentando, portanto, menor potencial de transmissão para humanos. Entretanto, Yersinia enterocolitica 1A, considerada não patogênica, foi isolada de todos os tipos de amostras, e a maioria apresentou fatores de virulência, devendo este fato ser melhor investigado. Os resultados apresentados indicam a necessidade de se tomar medidas para controle e prevenção da disseminação dos agentes, principalmente da Listeria monocytogenes.

Os rotavírus são os responsáveis pela ocorrência de diarreias em humanos e outras diversas espécies animais. Estão amplamente disseminados na suinocultura, inclusive no Brasil. As proteínas não estruturais 2 e 5 (NSP2 e NSP5) dos rotavírus estão envolvidas nas etapas de replicação viral, sendo essenciais para a formação do viroplasma, uma estrutura citoplasmática no interior da qual ocorre a morfogênese das novas partículas virais. Entretanto, são escassos os estudos sobre a diversidade genética destas proteínas em rotavírus circulantes nas criações brasileiras. Até o presente momento, a NSP2 pode ser classificada em nove genotipos (N1 ao N9) e a NSP5, 11 (H1 ao H11), sendo que em humanos foram descritos os genotipos N1, N2, N3 e H1, H2 e H3, e em suínos N1 e H1. Este estudo teve o objetivo de caracterizar as amostras circulantes de rotavírus em termos da diversidade da NSP2 e NSP5. Para isso, um total de 63 amostras fecais provenientes de criações de suínos localizadas em seis diferentes municípios do Estado de São Paulo, Brasil, foram previamente triadas mediante a técnica de nested-PCR. Destas, nove tiveram os respectivos segmentos genômicos amplificados pela reação de RT-PCR, sendo que em sete foi possível o sequenciamento nucleotídico parcial para NSP2 e, em seis, o sequenciamento total para NSP5. Todas foram caracterizadas como genotipo N1 e H1. Considerando o gene NSP2, nas amostras aqui definidas, a identidade nucleotídica variou de 100% a 86,4%, e em termos de aminoácidos, de 100% a 91,5%, enquanto que para NSP5 foi de 100% a 95,1%, e de 100% a 97,4% respectivamente para nucleotídeos e aminoácidos. Conclui-se que os genotipos das amostras circulantes na região de estudo estão em concordância com aqueles descritos na literatura para a espécie suína, e que há a hipótese de interação entre rotavirus de origem humana e animal. Estes dados são úteis para uma vigilância mais abrangente dos rotavírus circulantes e contribuem para uma melhor compreensão da patogenia, epidemiologia e prevenção da doença, inclusive no que diz respeito ao seu caráter zoonótico.

O Toxoplasma gondii apresenta uma estrutura populacional clonal. A análise genotípica do locus SAG2 foi realizada para determinar a ocorrência de diferentes linhagens de T. gondii (tipos I, II e III) em gatos domésticos. Amostras de soro de 237 gatos de 15 municípios no estado de São Paulo foram testadas para pesquisa de anticorpos anti-T. gondii através do teste de aglutinação modificado (MAT). Anticorpos (MAT &ge; 25) foram encontrados em 84 (35,4%) dos 237 gatos. Com os tecidos (cérebro, coração, língua e musculatura esquelética) de 71 gatos positivos foram realizados bioensaios em camundongos (cinco camundongos por grupo) sendo obtidos 47 isolados. A análise de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP) sobre produtos do locus SAG2 amplificados pela PCR revelou que 34 isolados (72,4%) eram do tipo I, 12 (25,5%) eram do tipo III e um (2,1%) apresentava infecção mista (tipo I e tipo III). Não houve isolado do tipo II. A maioria dos isolados do tipo I (23/34) causou o óbito de todos os camundongos infectados e a maioria dos isolados do tipo III (7/12) não levou ao óbito nenhum camundongo infectado. Foram encontrados cistos no cérebro dos camundongos infectados em todos os 47 isolados. A determinação genotípica também foi feita diretamente das amostras primárias dos gatos (homogeneizados de tecidos) usando a nested-PCR-RFLP. A caracterização do locus SAG2 foi bem sucedida em 80,4% (37/46) das amostras testadas. Os genótipos obtidos das amostras primárias foram idênticos aos dos isolados correspondentes. O genótipo misto foi confirmado pelo seqüenciamento direto de DNA dos produtos da PCR obtidos do isolado e da amostra primária do gato. Amostras dos cinco camundongos infectados com este isolado foram seqüenciadas. Três camundongos se infectaram com o genótipo tipo III, um com o genótipo tipo I e o outro com o genótipo misto, demonstrando que infecções mistas podem originar diferentes padrões de infecção em um hospedeiro.

A importância do pescado no Brasil tem crescido, principalmente nos últimos 50 anos, com a criação do Ministério da Pesca e Aquicultura, o aumento da produção pesqueira e do consumo de pescado per capita. A pescada-foguete Macrodon ancylodon pertence à família Sciaenidae é um peixe de alto consumo no Brasil. A qualidade do frescor do pescado é avaliada perante diferentes parâmetros: avaliações sensoriais, físico-químicas, microbiológicas, parasitológica e determinação de metais pesados, ou contaminantes inorgânicos. Para as avaliações foram coletados na CEAGESP 60 elementos amostrais para as avaliações sensoriais, microbiológicas, parasitológicas e de contaminantes inorgânicos (30 inverno / 30 verão). Para as avaliações físico-químicas foram coletados 33 elementos amostrais (15 inverno / 18 verão). Pela a avaliação sensorial as amostras do inverno e do verão tiveram resultados entre bom e moderado perante diferentes atributos avaliados. Pela avaliação físico-química os valores de BVT variaram de 7,410 a 39,240mg/100g; os valores de TMA variaram de 0,00 a 11,30mg/100g; os valores de TBA variaram de 0,250 a 1,070mgAM/100g; os valores de pH variaram de 6,890 a 7,200. Pela avaliação microbiológica a contagem de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis variou de 9,0x103 a 8,5x105UFC/g; a contagem de microrganismos psicrotróficos aeróbios estritos e facultativos viáveis variou de 1,9x104 a >2,5x107UFC/g; a contagem de coliformes totais variou de 8,0x10 a 1,8x105UFC/g; a contagem de coliformes termotolerantes variou de <10 a 7,5x102 UFC/g; não houveram testes positivos na pesquisa de Salmonella spp. Pela avaliação parasitológica 30% dos elementos amostrais foram positivos para anisaquíase, sendo encontrados 17 elementos com Contracaecum spp. e um com Pseudoterranova spp. Pela determinação de contaminantes inorgânicos, os valores de As variaram de 0,011 a 1,700mg/Kg; os valores de Cd variaram de 0,003 a 0,031mg/Kg; os valores de Cr variaram de 0,00 a 0,124mg/Kg; os valores de Pb variaram de 0,007 a 0,458mg/Kg; os valores de Hg total variaram de 0,001 a 0,099mg/Kg. Houve diferença estatisticamente significativa a 5% entre os grupos do inverno e do verão para os seguintes parâmetros: aceitabilidade da aparência e do frescor e intenção de compra na avaliação sensorial; BVT na avaliação físico-química; microrganismos mesófilos, microrganismos psicrotróficos e coliformes totais na avaliação microbiológica; As, Cr e Hg total na determinação de contaminantes inorgânicos. Foi verificado que a análise sensorial e a microbiológica são bons avaliadores do estado de frescor. A análise de BVT e a contagem de coliformes termotolerantes são bons indicadores do frescor da pescada. Os valores de pH obtidos sugerem que para a pescada Macrodon ancylodon ocorra variação em uma escala superior a de outras espécies de pescado. A região de origem parece influenciar nos resultados parasitológicos e de metais pesados. O presente trabalho deve contribuir com o setor da inspeção e sistemas de autocontrole da qualidade comercial e frescor do pescado marinho de origem extrativista nacional.

O objetivo do estudo foi caracterizar a situação epidemiológica da brucelose e tuberculose bovinas na região três do Estado de São Paulo. Assim, 260 rebanhos com atividade reprodutiva foram aleatoriamente selecionados e, dentro de cada um deles, 10 ou 15 fêmeas bovinas com idade igual ou superior a 24 meses foram aleatoriamente escolhidas e testadas para o diagnóstico da brucelose. Foi utilizado um protocolo de testes em série, tendo o teste do antígeno acidificado tamponado como método de triagem e o teste de fixação de complemento como confirmatório. Para o diagnóstico da tuberculose foi utilizado o teste tuberculínico cervical comparativo em 20 ou 40 fêmeas bovinas com idade igual ou superior a 24 meses. A prevalência de focos, tanto de brucelose quanto de tuberculose, foi de 7,3% [4,44%; 11,17%]; a prevalência de animais positivos foi de 1,37% [0,91%; 2,00%] para brucelose e 1,05% [0,73%; 1,46%] para tuberculose. Em cada propriedade foi aplicado um questionário epidemiológico para individualizar possíveis fatores de risco para as duas doenças. A variável associada à condição de foco de brucelose foi a propriedade ter 23 ou mais bovinos com idade igual ou superior a 24 meses (OR=5,0 [1,83; 13,7]); a aquisição de bovinos emergiu como fator de risco para a tuberculose (OR= 4,46 [1,55; 12,78]) .

A fragmentação de habitats e o aumento da proximidade entre as comunidades humanas, animais domésticos e silvestres podem ser responsáveis pelo aparecimento de doenças emergentes, disseminação de patógenos e alterações nos padrões epidemiológicos das doenças. Declínios populacionais em felinos silvestres devido a doenças já foram relatados, porém, pouco se conhece sobre o potencial papel dos patógenos nas populações de onça-pintada. Este estudo teve por objetivo pesquisar a presença de patógenos nas populações de onça-pintada e animais domésticos das regiões do Parque Nacional das Emas-PNE, Parque Estadual do Cantão-PEC e Pantanal sul mato-grossense, e identificar possíveis associações nos diagnósticos encontrados. Entre fevereiro de 2000 e janeiro de 2010, foram coletadas amostras biológicas de 31 onças-pintadas, 1246 bovinos, 179 cães e 36 gatos. Foram realizados diagnósticos sorológicos para brucelas lisas (AAT), Leptospira spp. (SAM), Toxoplasma gondii (MAT; RIFI), vírus da raiva (RFFIT), vírus da cinomose (SN), FIV e FeLV (SnapTM); e diagnósticos moleculares para Babesia spp., Hepatozoon spp., Cytauxzoon spp., Mycoplasma haemofelis, &#39;Candidatus Mycoplasma haemominutum&#39; e &#39;Candidatus Mycoplasma turicensis&#39;. Amostras de fezes de onças-pintadas foram analisadas para Giardia intestinalis, Cryptosporidium spp., protozoários da Família Sarcocystidae e Mycobacterium spp. O monitoramento das onças-pintadas, através do radiotransmissor, permitiu o mapeamento da ocorrência dos patógenos. As populações de bovinos das três áreas apresentaram alta exposição à B. abortus, mas apenas uma onça-pintada do PNE foi exposta à brucela lisa. Os sorovares mais prováveis de Leptospira spp. identificados em onças-pintadas do PNE e Pantanal foram distintos dos encontrados nos animais domésticos. As onças-pintadas, cães e gatos das três áreas foram altamente expostos ao T. gondii. Onças-pintadas do PNE e Pantanal foram expostas ao vírus da raiva, assim como as onças-pintadas do Pantanal e os cães das três áreas foram expostos ao vírus da cinomose. Dois gatos do entorno do PEC foram soropositivos para FeLV, mas nenhuma onça-pintada foi exposta ao agente ou ao FIV. Cães do entorno do PNE e do PEC foram positivos para Babesia spp., enquanto todas onças-pintadas foram negativas para o hemoparasita. Todas as onças-pintadas do Pantanal e PNE, e três de quatro onças do PEC foram positivas para Hepatozoon spp. e Cytauxzoon felis, sendo que cães e gatos também foram expostos ao Hepatozoon spp., mas não ao Cytauxzoon spp. As onças-pintadas das três áreas apresentaram alta exposição ao &#39;Candidatus Mycoplasma haemominutum&#39;, e alguns indivíduos do Pantanal e PEC foram positivos para o Mycoplasma haemofelis e &#39;Candidatus Mycoplasma turicensis&#39;. Poucos gatos foram positivos para os hemoplasmas felinos. Não houve evidências de exposição ao Mycobacterium bovis, e a presença de Cryptosporidium spp. e Giardia intestinalis foi detectada em onças do PNE. De acordo com os resultados, a cinomose e a raiva podem ser consideradas potenciais ameaças às populações de onça-pintada; a brucelose e a leptospirose podem ter sido transmitidas por animais domésticos; e, provavelmente as onças-pintadas possuem papel importante na manutenção do T. gondii, Cytauxzoon felis, Hepatozoon spp. e &#39;Candidatus Mycoplasma haemominutum&#39; no ambiente. Esses dados são relevantes e devem ser considerados na elaboração de estratégias para a conservação de onça-pintada na natureza.

Foi efetuado um inquérito epidemiológico do potencial zoonótico da população canina da Estância Turística de Ibiúna, SP. As zoonoses investigadas foram: leishmaniose, leptospirose, brucelose (B.canis), toxoplasmose, neosporose e doença de Chagas. As características analisadas foram: ocorrência, prevalência, distribuição espacial e fatores de risco. As colheitas de sangue foram efetuadas no período de 2007 a 2008 de uma amostra representativa (n=570), aleatória e estratificada da população canina do município. Por ocasião das colheitas de sangue os proprietários dos animais responderam a um questionário elaborado para permitir o cálculo dos fatores de risco. Os 48 bairros do município foram agrupados em quatro regiões caracterizadas por: região 1 composta por áreas mistas de urbanização recente, sem infra-estrutura adequada e com deficiência de serviços e áreas rurais formadas por pequenas propriedades agrícolas; região 2 de característica predominantemente rural formada por pequenas propriedades agrícolas e sítios circundados por áreas de mata; região 3 formada por área urbanizada que dispõe infra-estrutura organizada; região 4 também apresenta o predomínio de pequenas propriedades rurais para plantio e lazer, circundadas por áreas de mata. Não foram examinados animais do Parque Estadual de Jurupará. A leptospirose foi investigada pela técnica de soroaglutinação microscópica, com uma coleção de 24 sorovariedades de leptospiras, a leishmaniose por uma reação imunoenzimática, a brucelose (B.canis) por cultivo microbiológico e toxoplasmose, neosporose e doença de Chagas por imunofluorescência indireta. Os resultados obtidos foram analisados pelo teste de qui quadrado ou exato de Fisher, quando indicado, o nível de significância adotado foi o de 0,05. Foram encontrados animais reatores para as seis zoonoses estudadas, com taxas de prevalência de: 1,1%, 2,3%, 6,1%, 7,0%, 32,8% e 55,1%, respectivamente para: brucelose por (B.canis), leishmaniose, doença de Chagas, neosporose, leptospirose e toxoplasmose. As variantes sorológicas de leptospiras predominantes em ordem decrescente de ocorrência foram: Pyrogenes, Autumnalis e Canicola. As variáveis sexo masculino, idade adulta, presença de roedores, permanência nas vias públicas, ingestão de carne crua e atividade sexual foram caracterizadas como fatores de risco para leptospirose e toxoplasmose; a permanência nas vias públicas foi caracterizada como fator de risco para brucelose; sexo masculino, idade adulta e atividade sexual foram caracterizados como fatores de risco para neosporose; contato com carrapatos foi caracterizado como fator de risco para doença de Chagas. As prevalências de leishmaniose, leptospirose, brucelose, toxoplasmose e neosporose não diferiram segundo área rural ou urbana bem como nas quatro regiões em que o município foi dividido. A prevalência da doença de Chagas foi idêntica em área rural ou urbana, mas o valor observado na região 4 (bairros: Campo Verde, Rio Una de Cima, Ressaca e Paruru) foi superior ao encontrado nas demais.

Em trabalho recente, foi encontrada a infecção de 9,7% da população de Amblyomma triste por Rickettsia parkeri, agente etiológico de riquetsiose humana, na várzea do Rio Paraná, no município de Paulicéia. Desta forma o presente trabalho busco a soroprevelência de anticorpos anti-R. parkeri em humanos, cavalos, cães e gambás; e a prevalência de infecção por R. parkeri em ectoparasitas e diferentes áreas do local. Os carrapatos adultos e ninfas coletados foram identificados com chaves específicas e as larvas por técnicas moleculares (PCR para gene 16S rRNA mitocondrial, seguido de sequenciamento). Também foi feito o teste de presença de DNA de Rickettsia. Amostras de soro sanguineo de cães, cavalos e humanos foram analisadas pela técnica de reação de imunoflurescência indireta, para a pesquisa de anticorpos anti-R. rickettsii, R. parkeri, R. bellii, R. amblyommii, R. riphicephalii e R. felis. De 1699 carrapatos coletados, a maioria (1511) foi Amblyomma. Cajennense. Os demais pertenciam às espécies A. coelebs (6), A. triste (2), A. dubitatum (114), Rhipicephalus (Boophilus) microplus (55), Dermacentor nitens (10) e Amblyomma rotundatum (1). Somente 2 ninfas da espécie A. coelebs estavam infectadas com Rickettsia, com sequências 99% de identidade para o gene ompA R. amblyommii. Dos soros de humanos coletados 25 foram negativos e somente um apresentou títulos &le;64 para R. parkeri e R. rickettsii. De 140 soros dos equinos, 24% apresentou anticorpos anti-Rickettsia, com títulos variando de 64 a 1024, sendo que nove amostras tinham títulos anti-R. parkeri pelo menos quatro vezes maior que os para demais espécies de Rickettsia, indicando a R. parkeri como provável antígeno homólogo. Em 55 amostras de cães 7,7% apresentaram anticorpos anti-Rickettsia, com títulos variando de 64 a 256. Para duas amostras a R. parkeri foi o provável antígeno homólogo. Analisando os questionários epidemiológicos dos eqüinos, juntamente com os resultados sorológicos, a regressão logística indicou associação estatisticamente significante entre a presença de anticorpos anti-Rickettsia com as varáveis independentes (i) acesso à várzea (ii) e tempo de residência na região, os quais podem ser considerados fatores de risco para rickettsiose na região estudada. Foram capturados quatro gambás (Didelphis albiventris) e todos tinham anticorpos para R. parkeri, R. rickettsii, R. amblyommii e R. rhipicephalii, porém sem variação de pelo menos quatro vezes entre os títulos. Os gambás estavam infestados com ninfas A. cajennense e A. coelebs, todas negativas para o PCR para Rickettsia. Em vista destes resultados pode-se dizer que os animais domésticos e os gambás estiveram em contato com bactérias do gênero Rickettsia na região estudada, onde a várzea parece ser a principal foco de carrapatos infectados.

The aim of this study was to determine the serologic and molecular occurrence of Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp. and Hepatozoon spp. in ticks and domestic and wild animals from two conservation units in the city of Natal, Rio Grande do Norte State, Brazil. The collection period was between October 2012 and August 2013. Serum samples were tested against Rickettsia spp. antigens and Ehrlichia canis by Indirect fluorescent antibody test. Tissue samples and ticks were processed for molecular detection of the pathogens. Twenty-seven marsupials and four rodents were captured, and up to three animals of each species were euthanized. In addition, serum samples from 155 domestic animals: 53 cats living inside the units, 29 dogs domiciled around the areas and 73 dgos of the Zoonosis Control Center of the City (ZCC). Twenty dogs from ZCC were also euthanized and samples of spleen were obtained. Antibodies to at least one of the Rickettsia species tested were detected in six Didelphis albiventris and in one Rattus rattus; 17% (17/102) of the dogs presented antibodies to E. canis and 13% (20/155) of all tested domestic animals (dogs and cats) were seropositive for Rickettsia spp. antigens. Three species of ticks (Amblyomma auricularium, Ixodes loricatus and Ornithodoros mimon) were collected and one A. auricularium was positive for Rickettsia amblyommii by PCR. Two D. albiventris spleen samples amplified PCR products for Ehrlichia spp. Spleen samples from three D. albiventris and spleen and lung sample from one Necromys lasiurus were positive for Babesia spp. by PCR test. Among the 20 spleen samples from dogs subjected to molecular analysis, eight were positive by PCR for E. canis and two for H. canis

Foi realizado um estudo para determinar a situação epidemiológica da brucelose bovina no estado de Santa Catarina. O estado foi divido em cinco regiões conforme as características de produção pecuária. Para cada região foi estipulado o valor mínimo de 300 propriedades, sendo distribuídas de forma proporcional em todos os municípios. Como unidade primária da amostra, as propriedades foram amostradas aleatoriamente em cada município e, dentro delas, escolhida aleatoriamente uma quantidade pré-determinada de fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses, que foram testadas para o diagnóstico sorológico da brucelose. Este estudo utilizou amostras colhidas de 8.630 animais provenientes de 1.653 propriedades. Em cada propriedade sorteada, foi aplicado um questionário epidemiológico para verificar fatores de risco associados à infecção brucélica. O protocolo de testes utilizado foi a triagem com o Antígeno Acidificado Tamponado, seguido do teste dos reagentes com o 2-Mercaptoetanol (2-ME). Os animais com resultados inconclusivos no 2-ME foram retestados após 30 dias. A prevalência de focos foi de 0,912% [0,297 - 2,11]. As prevalências de focos, conforme a região, foram de 0,322% [0 - 0,959] na região 1, de 2,134% [0,862 4,348] na região 2, de 1,087% [0,297 - 2,760] na região 3, de 0,325% [0,0 - 0,968] na região 4 e de 0,293% [0 0,875] na região 5. A prevalência em animais em Santa Catarina foi de 1,21% [0,0951 4,97]. A prevalência em animais nas regiões 1, 4 e 5 foi igual a 0%, na região 2 foi de 1,02% [0,280 2,57] e na região 3 foi de 1,97% [0,106 - 8,84]. Este estudo revelou que os fatores de risco associados à condição de foco de brucelose no Estado foram: o tamanho do rebanho &gt; 12 fêmeas (OR = 7,47 [2,14 - 34,34]) e a presença de áreas alagadas (OR = 5,68 [1,62 - 26,13]). Utilizando um teste de duas proporções comparou-se as prevalências encontradas neste estudo e no estudo anterior (2002), sendo encontrada diferença significativa apenas na região 2, com valor de P&lt;0,05 (P=0,031). Dada a baixa prevalência encontrada, o sistema de vigilância deve ser incrementado visando a eliminação da doença no Estado

Técnicas de genotipificação do Mycobacterium bovis baseadas na amplificação do DNA via PCR como MIRU-VNTR constituem importantes ferramentas na investigação epidemiológica da tuberculose bovina (TB) em áreas de baixa prevalência, como no Estado de Mato Grosso. Isto posto e diante de limitadas informações a respeito dos genótipos grassantes no Estado, foi realizado monitoramento nas linhas de inspeção sanitária pós-abate em 35 matadouros-frigoríficos sob inspeção oficial para detectar lesões granulomatosas sugestivas de TB e proceder a coleta e análise de amostras. Foram processadas e analisadas 167 amostras mediante isolamento bacteriano e técnicas moleculares. Através do método de genotipagem MIRU-VNTR, 49 isolados de M. bovis foram analisados aplicando-se 24 pares de primers diferentes. Desses, 20 marcadores de VNTR mostraram polimorfismo genético. O locus QUB26 apresentou alto poder discriminatório (h=0,66) enquanto ETRC (0,54), Mtub21 (0,5), QUB11b (0,33) e Mtub34 (0,31) mostraram moderada diversidade alélica. Os outros 15 loci (Mtub 04, 29 e 39; MIRU 04, 16, 23, 24, 26, 27, 31, 39 e 40; ETR A; ETR B; QUB 4156) revelaram baixo poder discriminatório (h=0,02 - 0,27). Quatro loci (MIRU 2, 10 e 20; Mtub30) não apresentaram diversidade alélica. Foram observados 28 perfis genéticos (V1-V28) nos isolados de M. bovis obtidos em 35 propriedades rurais. Dentre essas, 30 (85,71%) apresentaram somente 1 tipo de perfil genético. Apenas 19 amostras (38,77%) apresentaram perfil MIRU-VNTR único revelando a existência de isolados com o mesmo perfil MIRU-VNTR entre diferentes regiões geográficas no Estado. O isolamento, seguido da identificação molecular e discriminação genotípica por MIRU-VNTR em isolados de M. bovis constituíram fontes de relevantes informações auxiliares no desenvolvimento de estratégias de erradicação da TB na região de estudo.

Canine brucellosis is a zoonotic disease, caused by Brucella canis, which is the main cause of abortion and infertility in dogs. This study had the objective to investigate a B. canis outbreak in a breeding kennel, to describe a multistep approach to characterize the B. canis isolates obtained, and to identify B. canis proteins specifically reacting with antibodies from naturally infected dogs. The kennel was located in São Paulo, SP, Brazil. At the time of sampling, in 2014, the kennel comprised 17 adult Pug dogs. Blood samples were used both to isolate the bacteria and to detect Brucella spp. DNA by the polymerase chain reaction. Serum samples were used to detect antibodies against B. canis using an immunocromatographic test, the rapid slide agglutination test with or without 2-mercaptoethanol and two ELISA kits. The Brucella isolates were characterized through the classical bacteriological tests, mass spectrometry and whole genome sequencing. The total protein content of Brucella isolates was extracted and separated using one and two-dimension polyacrylamide gel electrophoresis (1D and 2D, respectively), and then tested against sera collected from bacteremic, non-bacteremic and non-B. canis infected dogs using western immunoblotting. The reacting protein spots were identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Vaginal discharge, abortion, stillbirth, conception failure and general lymphadenopathy were the clinical signs found in the infected dogs. Gram-negative, coccoid rod-shaped bacteria were isolated from 24 blood samples. Antibodies against B. canis were detected in all dogs at least once by the performed serological tests. Mass spectrometry analysis assigned all isolates to the genus Brucella. The phenotypic data clearly identified the isolates as B. canis with only slight differences in phage typing patterns. The 2D separated protein spots were identified by MALDI-TOF MS as 93 different proteins, out of them, 19 were identified in infected dogs (during the bacteremic and non-bacteremic phases of the infection) and were not identified in non-infected dogs. These proteins have the potential to be used as antigens in serological tests in an attempt to improve the diagnosis of the infection, since a reliable diagnosis is an essential measure for the control and prevention of canine brucellosis. The multistep approach using classical microbiological methods, mass spectrometry and whole genome sequencing allowed the characterization of the B. canis with high discriminatory power, which may be useful for outbreak investigations.