Repositório RCAAP

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O espaço na Educação Infantil apresenta funções significativas no estímulo à criatividade, no desenvolvimento motor e no suporte emocional das crianças. A Educação Infantil contemporânea tem se voltado cada vez mais para práticas pedagógicas inovadoras que valorizam a construção da identidade das crianças. Nesse contexto, o espaço físico das escolas desempenha um papel fundamental, pois pode ser concebido como um recurso pedagógico capaz de potencializar o desenvolvimento integral das crianças, sobretudo em seu simbolismo – aspecto desdobrado nesta investigação. Compreendido esse panorama, esta dissertação tem, como objetivo geral, caracterizar o espaço educacional da Educação Infantil do Centro Educacional Pia-Máter a partir da concepção do espaço físico e simbólico na perspectiva de inovações educacionais. A escolha por essa unidade escolar localizada em Brasília-DF, Brasil, se deve à atenção que a equipe pedagógica e gestora dá ao uso e à construção dos espaços internos e externos da estrutura física e pedagógica da escola, sendo, inclusive, referência na Educação Infantil na região em que atua. A fundamentação teórica baseia-se em teóricos da educação, como Vygotsky, Dewey, Ausubel, Freire, entre outros, que destacaram a importância da experiência e da autonomia na educação, bem como em pesquisadores contemporâneos, como Prensky, Kishimoto, Goleman, entre outros, que ressaltaram a influência do brincar e das habilidades socioemocionais no desenvolvimento das crianças. A metodologia adotada na pesquisa é qualitativa, de abordagem exploratória, envolvendo uma revisão bibliográfica não sistemática para compreender profundamente o papel do espaço na Educação Infantil a partir do estudo de uma unidade escolar selecionada. A coleta de dados foi realizada por meio de pesquisa bibliográfica, pesquisa documental, formulário eletrônico e registro fotográfico dos espaços que apresentavam inovações educacionais significativas. A análise de dados envolveu o registro dos percentuais das respostas obtidas de treze pedagogas entrevistadas por meio do referido formulário eletrônico. Nesse formulário, havia tanto questões de múltipla escolha quanto questões discursivas. As respostas dessas últimas foram realizadas por meio da análise de conteúdo, seguindo o protocolo de Bardin. Os resultados obtidos pela análise dos espaços da unidade escolar selecionada e das respostas ao formulário eletrônico aplicado destacam a importância de um ambiente seguro, acolhedor e diversificado para o desenvolvimento cognitivo e socioemocional das crianças. Foram apontados também desafios a serem superados na escola selecionada, como a preferência por uma minoria das entrevistadas por atividades repetitivas, o que indicia a necessidade de práticas pedagógicas mais flexíveis. É recomendado, nesse sentido, a formação continuada dos profissionais da educação. De forma geral, este estudo contribui fornecendo uma caracterização abrangente dos espaços educacionais na Educação Infantil a partir do estudo da escola selecionada, identificando inovações educacionais relevantes e oferecendo sugestões práticas para melhorias alinhadas com as teorias contemporâneas consultadas. Este estudo incentiva, portanto, uma reflexão inicial e referencial do papel dos espaços físicos e simbólicos na Educação Infantil e reconhece a necessidade de pesquisas futuras para ampliar o entendimento do conceito de espaço na Educação Infantil.

Diante o recorrente discurso sobre a necessidade de inovar em educação, a dissertação Inquiry-Based Learning (IBL): uma realidade para professores dos Anos Iniciais do Ensino Fundamental, apresenta a Inquiry-Based Learning (Aprendizagem Baseada na Investigação) como uma abordagem educacional promissora e uma realidade para a instituição de ensino particular brasileira localizada na Região Sul do país, identificada neste trabalho como PIS. O objetivo principal deste estudo é investigar e analisar a Inquiry-Based Learning no contexto educacional da PIS. Mais especificamente, compreender as correntes e teorias pedagógicas que embasam a IBL, identificar suas principais características, possibilidades e desafios dentro do contexto escolar da instituição brasileira e entender como professores dessa mesma instituição se apropriam da IBL ao longo do ano letivo, de forma a motivar e envolver seus alunos no processo de ensino e aprendizado, promovendo o protagonismo discente por meio da investigação sobre os mais variados temas e da elaboração de perguntas de alto nível. O trabalho foi organizado em três capítulos: (1) IBL - Fundamentação e Influências; (2) IBL - Principais Características no Contexto Brasileiro e (3) IBL - Uma Realidade. A metodologia adotada para o desenvolvimento deste trabalho foi a qualitativa devido sua capacidade de capturar em profundidade as experiências e percepções dos envolvidos. A coleta de dados foi realizada por meio da observação não participante, onde várias turmas dos Anos Iniciais do Ensino Fundamental da PIS e áreas comuns como a biblioteca, o laboratório de ciências, o parquinho e o refeitório foram observadas; por meio de entrevistas semiestruturadas com duas professoras de diferentes turmas e anos de ensino do Ensino Fundamental da PIS e com a coordenadora pedagógica da Educação Infantil e Anos Iniciais do Ensino Fundamental da PIS e por meio da análise de documentos específicos da instituição. Ao final, espera-se que mais educadores se encantem com a IBL e considerem sua implementação como grande aliada de uma educação de qualidade.

O Decreto-Lei n.º 75/2008 reforçou a autonomia e a flexibilização organizacional e pedagógica, criando em simultâneo o cargo de Diretor, responsável pela gestão administrativa, financeira e pedagógica, alterando assim o anterior órgão de gestão colegial para um órgão de gestão unipessoal. O Decreto-Lei n.º 54/2018 estabeleceu princípios e normas para garantir a inclusão de todos os alunos, permitindo a cada escola delinear o seu modo de atuação. Estes dois diplomas, em conjunto, permitem, ao mesmo tempo que exigem, que cada Diretor adapte processos e mobilize os meios de que dispõe para que todos os alunos aprendam e participem. Os alunos da comunidade cigana parecem constituir um desafio acrescido, pois continuam a apresentar baixos índices de escolaridade, elevadas taxas de absentismo e abandono escolar. O Agrupamento de escolas (AE) no qual este estudo se centrou, situado na Área Metropolitana de Lisboa, não é exceção. Os alunos da comunidade cigana apresentam elevadas taxas de absentismo, comportamentos irregulares, retenções e risco de abandono escolar. Por essa razão, no âmbito desta dissertação de Mestrado em Educação, especialidade em Administração Educacional, pretendemos compreender que estratégias e medidas têm sido promovidas para promover a inclusão dos alunos da comunidade cigana. Para isso, analisámos as perceções da Diretora, equipa da Direção, Coordenador da Escola e Equipa de Intervenção Comunitária (composta por uma Psicóloga e uma Assistente Social) relativamente aos fatores que impedem e potenciam a inclusão dos alunos da comunidade cigana. Combinámos a realização de entrevistas semi-diretivas com a análise documental, a observação participante e o registo de um diário de campo. Entre as diferentes estratégias implementadas neste AE para reduzir as elevadas taxas de insucesso escolar dos alunos ciganos, destaca-se o Projeto Turma Mais, ao abrigo do qual os alunos mais velhos da comunidade cigana frequentavam aulas de Português e Matemática em conjunto, separados das suas turmas de origem. Este projeto contribuiu para que cerca de metade dos alunos que o frequentaram conseguissem ter concluído o 2.º ciclo. Ainda assim, não terá continuidade, dado que o comportamento e a assiduidade dos estudantes ciganos não melhoraram significativamente. Neste AE parece predominar uma grande desmotivação por não se terem conseguido obter os resultados esperados com os projetos implementados e uma descrença relativamente à possibilidade de se conseguir vir a promover a inclusão dos estudantes ciganos na escola. Colocando a tónica da resolução do problema na necessidade de alteração de comportamentos por parte da comunidade cigana, os atores escolares não põem em causa o modo como a instituição escolar, os programas e as metodologias de ensino-aprendizagem continuam a ser organizados. Já as técnicas (Psicóloga e Assistente Social) entendem que a escola deveria passar a disponibilizar um outro tipo de ofertas formativas e desenvolver estratégias pedagógico-didáticas de natureza mais prática e adequada aos interesses dos alunos da comunidade cigana. A cultura ágrafa da comunidade cigana, baseada na transmissão oral, sem escrita, diverge substancialmente da cultura letrada da escola. Esta diferença basilar cria desconfiança e resistência por parte da comunidade cigana e incompreensão por parte da escola. Apenas um trabalho consistente e continuado de parceria entre a escola, instituições de intervenção social e a comunidade cigana poderá diminuir o fosso que persiste entre estas instituições e resultar em processos de inclusão.

O presente relatório decorre de oito meses de estágio curricular na Direção-Geral de Educação (DGE), mais concretamente, na Direção de Serviços de Educação Especial e Apoios Socioeducativos (DSEEAS) e está inscrito no âmbito do Mestrado em Educação e Formação, com especialização em Organização e Gestão da Educação e Formação, do Instituto de Educação da Universidade de Lisboa. O relatório apresenta e caracteriza a cultura da DSEEAS, e dá conta de um estudo para compreender o papel da DSEEAS na implementação da política de educação inclusiva, mais concretamente através da formação dos vários atores escolares. Para tal recorreu-se à pesquisa arquivística, à entrevista semiestruturada e à observação participante como técnicas de recolha de dados. O relatório encerra com uma descrição das atividades realizadas ao longo do estágio e uma reflexão sobre as aprendizagens consolidadas na licenciatura e mestrado e o que foi possível aprofundar com estágio.

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o tipo de cancro mais frequente em crianças, sendo caracterizado pela expansão descontrolada de células linfóides não diferenciadas, podendo estas pertencer à linhagem de células B ou de células T. Apesar da opção terapêutica atual, constituída por ciclos de quimioterapia, atingir uma eficácia em que 90% dos doentes sobrevivem, esta sobrevivência é drasticamente reduzida em doentes com idade superior a 50 anos. Além disso, os pacientes que sobrevivem sofrem muitas vezes de efeitos secundários adversos da terapia ou até de uma recidiva mais resistente da doença, realçando, deste modo, a necessidade de encontrar alternativas terapêuticas mais eficazes, direcionadas, e com menos efeitos adversos. As células das linhagens B e T precisam de fatores externos para sobreviver, diferenciar e proliferar nos seus diferentes microambientes. Um destes fatores é a interleucina-7 (IL-7), cuja presença é essencial para a sobrevivência e maturação dos precursores linfóides. O eixo de sinalização da IL-7 depende do seu recetor na superfície das células B e T, o recetor da IL-7 (IL-7R). Este é constituído por duas subunidades, a subunidade α (IL-7Rα/IL7R) e a cadeia γ comum (ɣc/IL2RG), partilhada pelos recetores da IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. A ligação da IL-7 ao seu recetor desencadeia sinalização através de três vias principais: JAK/STAT, PI3K/Akt/mTOR e MEK/Erk, que convergem nos seus principais efeitos, sendo estes a promoção da expressão de genes associados a proliferação, sobrevivência e diferenciação. Todas estas vias de sinalização estão implicadas em LLA, estando normalmente desreguladas neste contexto, o que promove a progressão da leucemia. A IL-7 e o seu recetor estão também envolvidos no desenvolvimento de leucemia, através da ativação das vias de sinalização mencionadas. Diferentes estudos demonstraram que estimulação com IL-7 promove a proliferação e a sobrevivência de células leucémicas tanto in vitro como in vivo. Adicionalmente, existem doentes que possuem mutações no recetor da IL-7 que promovem a homodimerização aberrante de duas subunidades α, facilitando uma ativação anormal e constitutiva da sinalização, mesmo na ausência de IL-7. Assim, existe atualmente um esforço para melhorar o arsenal terapêutico contra a leucemia, sendo o eixo de sinalização mediado por IL-7 um alvo atrativo para o desenvolvimento de fármacos mais específicos contra as células leucémicas. O nosso laboratório realizou um ensaio com um painel constituído por múltiplos compostos químicos com o objetivo de encontrar novas classes de inibidores com atividade anti-tumoral em células dependentes de IL-7. Este painel revelou que inibidores de desacetilases de histonas (HDACs) são capazes de inibir, de uma forma previamente desconhecida, os efeitos da estimulação por IL-7. As HDACs são enzimas responsáveis por desacetilar uma grande variedade de substratos, incluindo não só histonas, mas também outras proteínas como fatores de transcrição (p53, STAT5, etc.), entre outros. Alterações do estado de acetilação de certas proteínas podem alterar a sua atividade, podendo assim existir um efeito terapêutico no tratamento com inibidores de HDACs. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar de que forma as HDACs interagem com as vias de sinalização associadas a IL-7 e avaliar, numa fase inicial, o potencial terapêutico do tratamento de células sensíveis à IL-7 com inibidores de HDACs. Começámos por avaliar de que modo um inibidor de HDACs, denominado SAHA ou vorinostat, afeta os efeitos positivos que a estimulação com IL-7 tem na viabilidade de duas linhas celulares dependentes de IL-7, D1, uma linha derivada de timócitos murinos dependente de IL-7, e Ba/F3 transduzidas de forma estável com o recetor wild type (WT) da IL-7 (Ba/F3 WT). Observámos que o tratamento com SAHA foi capaz de reduzir o aumento de viabilidade resultante de sinalização por IL-7, consoante a concentração do inibidor. O tratamento com SAHA foi também capaz de inibir o aumento de viabilidade celular promovido pela IL-7 em diferentes tipos de amostras primárias sensíveis à IL-7. Descobrimos ainda pela primeira vez dois mecanismos complementares pelos quais inibição de HDACs afeta o eixo de sinalização da IL-7. O primeiro mecanismo envolve a redução da expressão de IL7R. Diferentes amostras primárias sensíveis à IL-7 e a linha celular TAIL7 (derivada de células humanas de LLA de origem T dependentes de IL-7) tratadas com SAHA apresentam uma menor expressão génica de IL7R, com consequente redução da presença do recetor à superfície das células e da ativação das vias de sinalização por ele mediadas. Trabalhos anteriores demonstraram que um dos fatores de transcrição importantes para a regulação da sinalização de IL-7, denominado FoxO1, pode ser acetilado, sendo a sua acetilação capaz de diminuir a sua atividade transcricional e promover a sua fosforilação inativante. Uma vez que a expressão génica do recetor da IL-7 é regulada positivamente pelo fator FoxO1, testámos se a inibição de HDACs afeta a fosforilação de FoxO1 como possível consequência do aumento de acetilação na linha celular D1. Confirmámos que o tratamento com SAHA aumenta a fosforilação de FoxO1 além da fosforilação basal induzida pela estimulação com IL-7, solidificando a hipótese de que este fator de transcrição é afetado por HDACs, e que a sua acetilação facilita a sua fosforilação, reduzindo assim a expressão génica de IL7R. Contudo, o mecanismo associado à fosforilação de FoxO1 não pode ser o único mecanismo de ação dependente de IL-7 do SAHA, uma vez que as Ba/F3 WT também são afetadas pelo tratamento com este inibidor. Estas células não expressam o IL-7R murino, apresentando apenas uma expressão estável e constitutiva do recetor da IL-7 humano WT, derivado de transdução, sob regulação de um promotor viral independente de FoxO1 ativo. Assim, alterações no estado de acetilação de FoxO1 não justificam os efeitos observados em Ba/F3 WT, pelo que deve existir outro mecanismo pelo qual HDACis afetam as vias de ativação de IL-7. Com o objetivo de explorar esta hipótese, estas células foram tratadas com SAHA e avaliámos os seus efeitos na sinalização mediada por IL-7. Curiosamente, nenhum efeito foi observado em elementos necessários em fases mais iniciais da sinalização. Contudo, conseguimos observar uma redução nos níveis de ativação de alguns elementos mais tardios na cadeia de sinalização, nomeadamente na cinase S6K e na proteína ribossomal S6, dois elementos da via PI3K/Akt/mTOR. Em resposta ao tratamento com SAHA verificámos uma redução da fosforilação destes dois elementos, mesmo na presença de IL-7, indicando que este inibidor pode interferir no grau de ativação de alguns elementos das cadeias de sinalização, reduzindo assim os efeitos da IL-7 essenciais para a sobrevivência destas células. Uma vez que os nossos estudos sugerem que a IL-7 é capaz de ativar HDACs, resolvemos determinar qual de entre as vias de sinalização ativadas por IL-7 é a via responsável pela ativação de HDACs. A ativação de JAK1 promovida pela estimulação com IL-7 parece ser essencial para a atividade das HDACs, visto que na sua ausência, após tratamento com o inibidor de JAK1/2 ruxolitinib, não se observou a esperada redução do nível de acetilação de histonas resultante da atividade de HDACs induzida pela estimulação com IL-7. Várias questões continuam ainda sem resposta, tais como, quais as HDACs ativadas pela estimulação com IL-7, e se outros fatores de transcrição importantes para a expressão do IL-7R são afetados pelo tratamento com inibidores de HDACs. Apesar da necessidade de estudos futuros, este trabalho fornece fundamentos para testar o efeito da inibição de HDACs no tratamento de ALL in vivo usando modelos animais. Apesar das questões que ficaram em aberto, conseguimos clarificar quais as principais consequências funcionais que o tratamento com inibidores de HDAC têm em células dependentes de IL-7, quer a nível da redução da expressão génica de IL7R, quer a nível da inativação das vias de sinalização por ele mediadas. Conseguimos ainda identificar JAK1 como um elemento de sinalização essencial para a ativação de HDACs dependente de IL-7. Este trabalho permitiu solidificar as bases para o estudo de HDACis para o tratamento de ALL sensível à IL-7, realçando o seu valor terapêutico. Em última análise, os resultados aqui apresentados revelam o importante elo entre IL-7 e HDACs, e consequentemente uma ligação previamente pouco reconhecida entre a sinalização de IL-7 e modificações epigenéticas.

Segurança e insegurança são aqui pensadas através de um enfoque exploratório aberto, deliberadamente demarcado de enquadramentos recentes que têm vindo a fechar o âmbito destas noções numa só das suas dimensões, isolando-a da complexa relação que mantém com outras. Ao fazê-lo, têm-na também abstraído do conjunto de aspetos da vida social em que se encontra imersa. Retomando em toda a sua plenitude o âmbito semântico de tais noções, no qual se incluem conotações de estabilidade, previsibilidade, proteção, ou, ao invés, vulnerabilidade e precariedade, examinamos as sucessivas reduções de sentido e ambiguidades que as envolvem. Ao resgatá-las assim ao quadro redutor em que têm vindo a ser encerradas, pretendemos reconquistar a amplitude analítica necessária para acolher em tais categorias os aspetos relativos à produção de segurança ou insegurança a quaisquer níveis em que se apresentem, desde noções ideológicas e perceções culturais até relações sociais e práticas institucionais, passando pelo funcionamento do Estado e dos seus atores. É neste quadro que se apresentam, articulados, os conteúdos deste dossiê.

Ivermectin is a sixteen-membered macrolactone "wonder drug" of Nobel prize-honored distinction that exhibits a wide range of antiparasitic activities. It has been used for almost four decades in the treatment of various parasitic diseases in humans and animals. In this paper, we describe the synthesis of the first-in-class ivermectin derivatives obtained via derivatization of the C13 position, along with the unexpected rearrangement of the oxahydrindene (hexahydrobenzofuran) unit of the macrolide ring. The structural investigation of the rearrangement has been performed using the single-crystal X-ray diffraction method. The antiparasitic and cytotoxic activities of the newly synthesized derivatives were determined in vitro with the bloodstream form of Trypanosoma brucei brucei, the hepatic stage of Plasmodium berghei, and human leukemia HL-60 cells. The compounds with the highest trypanocidal activity were the C13-epi-2-chloroacetamide analogs of native (6h) or rearranged (7h) ivermectin. Both 6h and 7h displayed trypanocidal activities within a similar mid-nanomolar concentration range as the commercially used trypanocides suramin and ethidium bromide. Furthermore, 6h and 7h exhibited a comparable cytotoxic to trypanocidal ratio as the reference drug ethidium bromide. The double-modified compound 7a (C13-epi-acetamide of rearranged ivermectin) exhibited the highest activity against P. berghei grown in human hepatoma cells, which was 2.5 times higher than that of ivermectin. The findings of this study suggest that C13-epi-amide derivatives of ivermectin are suitable leads in the rational development of new antiparasitic agents.

Hypervirulence and carbapenem-resistant have emerged as two distinct evolutionary pathotypes of Klebsiella pneumoniae, with both reaching their epidemic success and posing a great threat to public health. However, as the boundaries separating these two pathotypes fade, we assist a worrisome convergence in certain high-risk clones, causing hospital outbreaks and challenging every therapeutic option available. To better understand the basic biology of these pathogens, this review aimed to describe the virulence factors and their distribution worldwide among carbapenem-resistant highly virulent or hypervirulent K. pneumoniae strains, as well as to understand the interplay of these virulence strains with the carbapenemase produced and the sequence type of such strains. As we witness a shift in healthcare settings where carbapenemresistant highly virulent or hypervirulent K. pneumoniae are beginning to emerge and replace classical K. pneumoniae strains, a better understanding of these strains is urgently needed for immediate and appropriate response.

só promovam uma melhor eliminação deste tipo de leucemia como reduzam os efeitos adversos associados ao tratamento. A via de sinalização PI3K está associada ao desenvolvimento de leucemia e, anteriormente, o nosso laboratório descreveu um mecanismo não genético que leva à sua ativação constitutiva com consequente impacto na viabilidade e proliferação das células leucémicas. Este mecanismo envolve a fosforilação inibitória de PTEN, o principal antagonista desta via de sinalização, levada a cabo pela CK2 que, como descrito anteriormente, tem um papel fundamental na regulação do RMC. Outros elementos da via PI3K/Akt/mTOR foram implicados na manutenção das oscilações promovidas pelo RMC. No entanto, o conhecimento relativo à interação da via PI3K com a maquinaria de controlo circadiano e o papel do RMC no desenvolvimento de LLA-T mantem-se limitado. Deste modo, o trabalho elaborado nesta dissertação visou caracterizar a interação entre o RMC e a via de sinalização CK2/PI3K/Akt/mTOR e usar o conhecimento obtido no sentido de desenvolver terapias dirigidas cuja administração tenha em conta as oscilações circadianas (cronoterapia). Esta estratégia deverá não só incrementar a eliminação das células de LLA-T como diminuir os efeitos secundários associados. Adicionalmente, pretendeu-se ainda descrever o impacto da inativação de Bmal1 da linhagem linfóide tanto na hematopoiese como no desenvolvimento de LLA-T ao analisar um modelo de ratinho gerado no laboratório. Vários autores descreveram que, apesar de diminuídas, as células cancerígenas continuam a apresentar oscilações circadianas. Para confirmar que este é o caso em células de LLA-T, linhas celulares foram transduzidas com um plasmídeo viral que contem um repórter circadiano. Deste modo, fomos capazes de demonstrar que as células leucémicas exibem oscilações circadianas robustas e mantidas ao longo do tempo. Tendo caracterizado as oscilações basais, procurámos determinar se elementos da via de sinalização CK2/PI3K/Akt/mTOR podem ser responsáveis pela manutenção das mesmas. Para isto, averiguámos o impacto da inibição farmacológica de elementos desta via nas oscilações previamente descritas. O bloqueio individual de CK2, PI3K ou mTOR com inibidores específicos levou a uma diminuição da ritmicidade das células leucémicas, caracterizada pelo aumento do período das oscilações e concomitante diminuição da sua amplitude. Estes resultados não só demonstram uma interação entre os elementos da via de sinalização inibidos e o RMC como a importância da mesma para oscilações circadianas funcionais. Seguidamente, procurámos estabelecer se os elementos da via PI3K/Akt/mTOR oscilam ritmicamente. Para este efeito, levou-se a cabo a recolha de células leucémicas em intervalos de 4 horas durante um período de 24 horas e posterior análise da ativação da via, através de western-blot. Foi possível detetar oscilações circadianas nas principais proteínas desta via de sinalização. Uma vez que a via PI3K/Akt/mTOR apresenta oscilações circadianas nas células de LLA-T e tendo por base o perfil das mesmas, foram desenvolvidos protocolos cronoterapêuticos para administração de um inibidor de PI3K (BKM-120) nos pontos de menor e maior ativação da via. A administração de BKM-120 de acordo com os níveis de ativação da via PI3K/Akt/mTOR leva a um impacto diferencial tanto na viabilidade como na proliferação das duas linhas celulares testadas. De facto, um dos esquemas de cronoterapia implementados aparenta ter maior sucesso na eliminação das células de LLA-T em detrimento dos restantes dois testados. Tendo em conta os resultados, coloca-se a possibilidade do estado da fosforilação de Akt na serina 473 (Ser473) estar subjacente ao sucesso da terapia com BKM-120. Concretamente, estados de menor fosforilação de Akt na Ser473 correspondem à melhor altura para inibir PI3K. Em contraste, tratar as células no pico de fosforilação da Ser473 de Akt leva a uma menor eficácia na eliminação das células leucémicas. Estas observações requerem, no entanto, confirmação. Para este efeito, caracterizámos o impacto da modulação do RMC com recurso a agonistas de REV-ERB nas oscilações da via PI3K/Akt/mTOR. Tendo em conta as alterações promovidas por estes agonistas pretendemos, no futuro, combinar a sua utilização e a cronoterapia com BKM-120 de forma a confirmar a importância da fosforilação de Akt na Ser473 ou de outros elementos para o sucesso da terapia com base nas oscilações circadianas destas proteínas. De forma a descrever o papel do RMC no desenvolvimento LLA-T, foi gerado um modelo de ratinho com Bmal1 especificamente inativado na linhagem linfoide. Após sacrificar estes ratinhos, as células da medula foram recolhidas e transduzidas com a porção intracelular de NOTCH1 (ICN1, um oncogene em LLA-T). Posteriormente, estas células foram injetadas nos hospedeiros e o desenvolvimento de doença foi comparado entre leucemias com e sem expressão de Bmal1. Resultados preliminares sugerem que abolir o RMC tende não só a acelerar o desenvolvimento da doença como originar um fenótipo mais agressivo. Apesar de necessitarem de confirmação, estes resultados refletem o papel de RMC no desenvolvimento de LLA-T, que pode ter consequências ao nível do tratamento. Sumariamente, o trabalho apresentado nesta dissertação permitiu concluir que existe uma interação entre o RMC e a via de sinalização CK2/PI3K/Akt/mTOR em LLA-T e iniciar a sua caracterização. Por sua vez, esta caracterização permitiu testar de forma informada diversos esquemas de cronoterapia que revelaram a importância da adequação do tratamento às oscilações circadianas para uma melhor eliminação da LLA-T. Adicionalmente, inativar Bmal1 leva a uma antecipação da doença, sugerindo que Bmal1 tem um papel de supressor tumoral em LLA-T e ilustrando a importância potencial do RMC no desenvolvimento da LLA-T. À luz destes resultados podemos concluir que o ritmo circadiano interseta a biologia da LLA-T. Atendendo à natureza pleiotrópica do ritmo circadiano esta interação pode ser importante não só na LLA-T como noutras doenças hematológicas e também em tumores sólidos, emergindo assim como uma nova perspetiva no tratamento do cancro.

A medicina portuguesa ficou mais pobre com o desaparecimento recente do professor Fernando de Pádua, líder incontornável durante décadas, que inspirou várias gerações de médicos, como a minha. E foi um líder na verdadeira acepção da palavra, deixando um legado absolutamente extraordinário, simbolizado não só na imensa obra feita ao longo de anos, mas, sobretudo, na plêiade enorme de discípulos que formou e nos quais deixou bem vincada a sua marca. Deixo aqui extratos do discurso que proferi na altura em que lhe foi justamente atribuído o Prémio Saúde Sustentável, em 2018, e que resumem um pouco quem foi este homem notável que a todos tocou para sempre e que tenho a honra de chamar de mestre.

Trypanosoma brucei (T. brucei) é um parasita unicelular e extracelular responsável pela doença infeciosa tripanossomíase africana que infeta humanos e mamíferos ungulados. Esta doença, em humanos, é conhecida como tripanossomíase humana ou doença do sono, enquanto que em animais denomina-se de tripanossomíase animal ou nagana. A doença do sono é alvo de eliminação pela Organização Mundial da Saúde até 2030, tendo menos de mil casos sido registados em 2019. Atualmente, a nagana apresenta um elevado impacto económico na casa dos biliões de dólares não só em perdas de produção de gado, mas também da consequente perda em alimentação e agricultura. Na África subsariana, os parasitas são transmitidos ao hospedeiro mamífero através da picada da mosca tsé-tsé (género Glossina) e ao longo do seu ciclo de vida os parasitas apresentam várias formas adaptadas ao ambiente em que se encontram. Existem várias subespécies de T. brucei sendo que apenas as subespécies T. brucei gambiense e T. brucei rhodesiense são patogénicas para humanos, por resistirem à lise por soro humano normal, causando infeções crónicas e agudas, respetivamente. Em investigação biomédica, infeções experimentais são maioritariamente realizadas utilizando parasitas da subespécie T. brucei brucei uma vez que não são infeciosos para humanos. A maioria dos estudos relacionados com a bioquímica e biologia molecular do parasita tripanossoma utilizaram como modelo a estirpe Lister427, uma estirpe considerada monomórfica uma vez que perdeu a capacidade de diferenciação da forma replicativa slender para a forma stumpy, que está sequestrada no ciclo-celular em G1/G0 e adaptada à transmissão de volta ao vetor de transmissão, a mosca tsé-sté. Os nomes fazem referência à morfologia que os parasitas aparentam em cada uma das suas formas, nomeadamente alongada e atarracada, respetivamente. Mais recentemente, estudos relacionados com a capacidade de diferenciação do parasita têm utilizado como modelo a estirpe pleomórfica (possui a capacidade de diferenciação entre as formas slender e stumpy) EATRO1125 (clone AnTat 1.1E 90:13), que está adaptada às condições laboratoriais uma vez que já passou por inúmeras passagens em cultura e em roedores desde que foi clonada em 2004. Dentro do hospedeiro, para além de circularem na corrente sanguínea, os parasitas T. brucei são capazes de colonizar os tecidos sendo que os reservatórios descritos com mais relevância até ao momento são a pele, o sistema nervoso central, o tecido adiposo e o pâncreas. Em 2016, duas novas estirpes de T. brucei brucei, denominadas MAK65 e MAK98, foram isoladas de vacas no Uganda em alturas diferentes do ano, fevereiro e julho respetivamente. Atualmente existe apenas um artigo científico, Mulindwa et al. 2021, que utiliza as estirpes MAK como modelo e as caracteriza. Neste estudo, o laboratório Figueiredo quis aprofundar o conhecimento existente sobre estas duas novas estirpes de parasitas, nomeadamente perceber o quão semelhante era o comportamento das estirpes MAK em relação à estirpe tipicamente usada no laboratório EATRO1125 tanto em cultura (in vitro) como em modelos animais (in vivo). Em cultura, observámos que o tempo que leva para a população de parasitas duplicar foi, para MAK65, aproximadamente duas vez inferior ao calculado para MAK98 (~6h vs ~10h, respetivamente). Para EATRO1125 foi observado um tempo intermédio de duplicação, nomeadamente ~8h30min. Surpreendentemente, ratinhos (C57BL/6J e BALB/cByJ) infetados com ambas as estirpes MAK desenvolveram híper parasitemia (densidades de parasitas no sangue muito elevadas - entre 108-109 parasitas por mililitro de sangue) que resultaram na morte dos ratinhos durante as duas primeiras semanas de infeção. A sobrevivência dos ratinhos infetados com MAK65 foi até 7 dias mais curta do que a dos ratinhos infetados com MAK98, revelando que MAK65 é uma estirpe mais virulenta. Por outro lado, nas infeções com a estirpe EATRO1125 foi observado um característico primeiro pico de parasitemia com um máximo registado abaixo dos 108 parasitas por mililitro de sangue e a infeção desenvolvida foi crónica, os ratinhos sobreviveram, excluindo pontuais exceções, após o dia 30 de infeção. Para testar se os elevados níveis de parasitemia observados eram devidos a uma incapacidade dos parasitas MAK65 e MAK98 de se diferenciarem nas formas não-replicativas stumpy, os níveis de expressão de genes marcadores de formas slender e stumpy foram quantificados em parasitas extraídos aos dias 5/6 após-infeção através da técnica de PCR quantitativo (RT-qPCR). Os parasitas MAK98 apresentam um perfil stumpy semelhante ao observado na estirpe EATRO1125, indicando que a incapacidade de diferenciação dos parasitas não está na origem do desenvolvimento da híper parasitemia. Por outro lado, a estirpe MAK65 apresentou padrão de expressão que não era um clássico perfil de slender nem um de stumpy, indicando que o seu mecanismo de diferenciação pode diferir das estirpes EATRO1125 e MAK98. Um fator importante adicional que controla os níveis de parasitemia é a resposta imunitária. Infeções realizadas em ratinhos Rag2-/- (não possuem nem células T nem B maduras) mostraram, em contraste com o que é observado em infeções por EATRO11255, que o sistema imune adaptativo não teve um impacto considerável na sobrevivência e curva de parasitemia nas infeções com as estirpes MAK. Estes resultados sugerem que estas estirpes conseguem superar o controlo do sistema imune adaptativo e que a causa da morte dos ratinhos infetados com as estirpes MAK provavelmente não é devida a imunopatologia. A severidade global da doença também foi avaliada com o seguimento do peso corporal durante infeção por T. brucei. Em geral podemos afirmar que, independentemente da estirpe de parasita utilizada, os ratinhos C57BL/6J têm uma tendência superior para perder peso do que os ratinhos BALB/cByJ. Para compreender mais extensivamente as variações de peso corporal observadas, foi realizada uma experiência de medição da composição corporal através da técnica de ressonância magnética nuclear. Comparavelmente a EATRO1125, infeções com as estirpes MAK levaram à perda de massa gorda. Adicionalmente, em infeções crónicas com a estirpe EATRO1125 observámos que os ratinhos C57BL/6J tinham tendência para perder massa magra enquanto que os ratinhos BALB/cByJ tinham tendência para ganhar. Os baços destes últimos animais aumentaram cerca de 10 vezes em relação aos controlos não infetados, podendo ser uma explicação para o aumento da massa magra verificado. Foi-nos possível isolar parasitas do tecido adiposo gonadal de ambas as estirpes MAK o que possibilita futuros estudos nestas formas dos parasitas, que na estirpe EATRO1125 estão reportados como sendo parasitas de crescimento lento com um transcriptoma diferente dos parasitas do sangue. Por último, o tropismo nos tecidos foi avaliado através da quantificação da quantidade de parasitas nos órgãos principais através da técnica PCR quantitativo (qPCR). MAK98 acumula-se preferencialmente no pâncreas e no tecido adiposo, órgãos anteriormente reportados como sendo reservatórios extravasculares em infeções com EATRO1125. MAK65 também se acumulou no tecido adiposo, no entanto o pâncreas foi o órgão menos colonizado nesta estirpe. De salientar que ambas as estirpes MAK acumularam em maiores quantidades em órgãos vitais, como os rins e o cérebro, que a estirpe EATRO1125, sugerindo que a colonização destes órgãos pode estar relacionada com a sua virulência exacerbada. Em conclusão, o nosso estudo sublinha a importância de utilizar múltiplas estirpes quando analisamos fenótipos de infeção uma vez que a patologia pode ser dependente da estirpe de parasita usada. Adicionalmente, este trabalho propõe que MAK65 ou MAK98 possam ser um bom modelo para estudar doença aguda, não só pelo seu fenótipo, mas também por terem mostrado ser fáceis de manter em ambiente laboratorial. Apesar de EATRO1125 continuar a ser um bom modelo para estudar tripanossomíase africana crónica, novos modelos devem ser introduzidos para criar a diversidade necessária para procurar variabilidade fenotípica.