Repositório RCAAP

Introdução O uso compassivo de drogas constitui uma opção terapêutica com popularidade crescente, em particular entre doentes terminais com necessidade de cuidados paliativos. Uma vez esgotados os tratamentos disponíveis, sem resultados satisfatórios, o uso compassivo permite um rápido acesso a drogas experimentais que de outra forma apenas estariam disponíveis através de ensaios clínicos ou após aprovação do medicamento. Torna-se assim imperativo perceber qual o impacto do uso compassivo na população paliativa e determinar se o mesmo é benéfico, bem como aferir quais as justificações éticas para o seu uso, dada a natureza excecional deste tipo de tratamento. A fim de responder a estas questões, conduzimos uma Scoping Review de forma mapear a literatura no que diz respeito ao uso compassivo de drogas em doentes paliativos para o controlo de sintomas e justificações éticas para a sua utilização. Métodos Para determinar os critérios de elegibilidade desenvolvemos uma estratégia PICOD, sendo os participantes quaisquer doentes com necessidades paliativas, independentemente do sexo, idade e diagnóstico; a intervenção, qualquer droga usada em contexto de uso compassivo; o controlo/comparação, qualquer descrita pelos estudos, nomeadamente placebo ou tratamento de base; os outcomes, controlo de sintomas e problemas éticos; para o tipo de estudo, foram considerados clinical trials, case reports/studies, case series, e expert opinions. Foram pesquisadas as bases de dados PubMed, EMBASE e Cochrane para artigos publicados entre 1 de Janeiro de 2012 e 31 de Dezembro de 2022. 5 Resultados O protocolo de pesquisa revelou quatro estudos elegíveis para revisão e análise qualitativa. As referências bibliográficas dos estudos incluídos foram avaliadas tendo sido encontrada uma outra publicação elegível, totalizando cinco os estudos incluídos nesta revisão. Destes, três abordam a temática do controlo de sintomas e os outros dois as justificações éticas para o uso compassivo. Diferentes tipos de estudo foram incluídos: um ensaio clínico não randomizado e não controlado, um case series, dois case reports e um expert opinion. Os doentes oncológicos compreenderam quatro dos cinco estudos incluídos. O número total de doentes que receberam tratamento por uso compassivo foi 28. O risco geral de viés dos estudos foi considerado moderado a baixo. Breuer et al, em Israel, apresentaram através de um case report uma primeira descrição de uma doente com neoplasia do pâncreas inoperável tratada com uma combinação de quimioterapia standard e a TL-118, uma droga experimental requisitada para uso compassivo. Neste caso, a mulher de 75 anos realizou a terapêutica combinada com subsequente monitorização imagiológica e analítica por tomografia computorizada e níveis do marcador tumoral CA-19-9, respetivamente. Raus K., na Bélgica, através de um expert opinion, examinou justificações éticas comuns para o uso compassivo de drogas experimentais. Neste estudo, o autor comparou programas de uso compassivo com ensaios clínicos randomizados e controlados. Panfilis et al., na Itália, através de um case report, ilustraram os perfis éticos e clínicos emergentes da questão do uso compassivo e procuraram promover uma reflexão moral entre os médicos requisitantes e fornecer recomendações sobre como solicitar o uso compassivo de drogas. Neste estudo foi realizada uma análise retrospetiva sobre um pedido de Avelumab para uso compassivo para uma doente com carcinoma de células de Merkel. Os autores exploraram a discussão do Comité de Ética sobre a solicitação e conduziram 5 entrevistas semiestruturadas aos médicos intervenientes, nomeadamente o oncologista, paliativista e três membros do Comité de Ética envolvidos no caso. Gupta et al., na Índia, através de um ensaio clínico não randomizado e não controlado, avaliaram a segurança e a eficácia do antigénio de membrana específico 6 da próstata lutécio 177 (Lu-177-PSMA) em doentes com cancro da próstata metastático resistente à castração (mCRPC) com baixo performance status. Neste estudo, 22 doentes (idade mediana 69 anos) realizaram um ciclo de tratamento com Lu-177-PSMA, por uso compassivo, em média 35 meses após o diagnóstico. A eficácia terapêutica foi avaliada pré- e 8 semanas após a intervenção, tendo sido registados o desempenho físico através da escala Eastern Cooperative Oncology Group, (ECOG) e a dor por meio da escala analógica visual da dor e da escala de quantificação analgésica. Finalmente, Corti et al., na Itália, através de case series, avaliaram retrospetivamente a atividade diferencial do Avapritinib em doentes com melanoma da mucosa metastático e carcinoma tímico, portadores de mutações KIT no exão 17. Quatro doentes (idade média de 44,5 anos), dois com melanoma da mucosa e dois com carcinoma tímico, foram tratados com a nova droga, através de um Programa de Uso Compassivo. Relativamente ao controlo de sintomas Gupta et al, concluíram que a terapêutica com Lu-177-PSMA fornecia paliação adequada para os doentes em estado final do cancro da próstata resistente à castração. Este estudo revelou diferenças estatisticamente significativas na performance física (p=0.014 na escala ECOG), e controlo da dor (p<0.001 e p=0.001, na escala visual analógica da dor e na escala de quantificação analgésica, respetivamente). A análise quantitativa indicou uma melhoria de 2 e 1 pontos na escala visual analógica da dor em 54,6% e 22,7% dos doentes, respetivamente, e uma melhoria de pelo menos 1 ponto na escala de quantificação analgésica em 54,6% e de 2 pontos absolutos em 13,6% dos doentes. Relativamente à performance física, verificou-se uma melhoria de um ponto na escala ECOG em 27,3%, que poderá ser explicada pelo melhor controlo da dor. Breuer et al, reportaram a resolução dos sintomas, descritos como dor abdominal, no terceiro mês de quimioterapia combinada com TL-118. Já no case series, Corti et al. apenas documentaram melhoria das condições clínicas no Caso 2. Adicionalmente o Caso 4 revelou progressão da doença, não tendo sido observado qualquer controlo de sintomas. Os restantes dois casos deste estudo não descreveram a evolução dos sintomas, sendo as conclusões limitadas aos dois casos anteriormente explanados. 7 No que diz respeito às justificações éticas, Raus K. identificou os três princípios mais frequentemente usados: a justiça, a beneficência e a autonomia. O uso compassivo é defendido como uma oportunidade terapêutica justa, uma vez que estende a rede de tratamento além dos ensaios clínicos, permitindo que doentes necessitados possam também beneficiar de novas oportunidades de tratamento. Por outro lado, é invocado o princípio da beneficência, uma vez que o beneficio conferido pelo tratamento experimental poderá suplantar o já mau prognóstico associado aos doentes terminais. Finalmente, através do uso compassivo é reconhecida a autonomia do doente terminal, capaz de dar o seu consentimento informado. Não obstante, o autor aponta inconsistências nestes argumentos, nomeadamente a atual iniquidade no acesso ao uso compassivo de drogas, a possibilidade de dano físico e económico, bem como o potencial risco de exploração dos doentes. Por último o autor argumenta que o consentimento informado pode ser nestes casos ameaçado pelo otimismo terapêutico e frequente ausência de uma entidade responsável pela supervisão do processo e qualidade do consentimento informado. Panfilis et al. verificaram que a aprovação do Avelumab para uso compassivo teve várias condicionantes. A avaliação do Comité de Ética incidiu sobre as condições de segurança, eficácia e impacto na qualidade de vida, a necessidade de comunicação clara e realista, o direito à esperança e o acesso simultâneo a Cuidados Paliativos. Em última instância a aprovação do tratamento foi condicionada pelo conhecimento prévio da doente sobre a existência da opção terapêutica, transmitida como sendo a única, e a necessidade de aprovação pelo referido comité. Assim, embora a eficácia e segurança do tratamento não pudessem ser garantidas, a solicitação não poderia ser negada pela risco de ser interpretada como uma negação da última esperança, com um forte impacto negativo sobre a qualidade de vida da doente. Neste estudo a abordagem simultânea, compassiva e paliativa, foi considerada crítica para garantir a qualidade de vida da doente. Adicionalmente, a observação pelo médico paliativista foi usada como veículo para confirmar o consentimento informado, com posterior aprovação do pedido de uso compassivo. 8 Conclusão Embora exista alguma evidência de que o uso compassivo de drogas possa ajudar no controlo dos sintomas em doentes paliativos, é necessária mais investigação para confirmar a sua eficácia. Este trabalho revela uma escassez de dados publicados e sublinha a necessidade de uma investigação mais aprofundada sobre o uso compassivo na população paliativa, com particular foco no controlo de sintomas. Além disso, embora existam justificações plausíveis em suporte do uso compassivo, é fundamental garantir que os princípios de justiça, beneficência e autonomia são respeitados durante o processo.

Objetivos: Durante a Oxigenação por Membrana Extracorporal (ECMO) domina um estado pró-coagulante, determinando o uso de anticoagulação, sendo a heparina não fracionada (UFH) o anticoagulante de escolha. A dificuldade no controlo da dose de heparina, para prevenir eventos hemorrágicos ou trombóticos, estabelece a necessidade da existência de um método confiável e amplamente disponível para monitorizar a anticoagulação. O objetivo deste estudo é avaliar a relação entre a dose de heparina e o tempo de coagulação activada (ACT), o Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (aPTT) e o Anti-Factor Xa. Métodos: Foi realizado um estudo prospetivo observacional na Unidade de Cuidados Intensivos Pediátricos (PICU) de um hospital universitário. Em todos os pacientes pediátricos sob ECMO durante um período de seis meses (Julho a Dezembro 2022) registou-se simultaneamente o valor de UFH e de Anti-Xa, ACT e aPTT. Para comparar os diferentes métodos utilizou-se o coeficiente de correlação de Spearman e de Pearson. Resultados: Durante o período do estudo, obtiveram-se 61 amostras de sangue de 6 pacientes diferentes. Os estudos de correlação revelaram uma correlação moderada mas estatisticamente significativa entre aPTT e Anti-Xa (r=0,540; p<0,001), mas nenhuma correlação foi encontrada entre ACT e Anti-Xa (r=-0,172; p= NS). Encontrou-se uma forte correlação entre a dose de UFH e o Anti-Xa (r = 0,729; p < 0,001), uma correlação moderada mas significativa entre a dose de UFH e o aPTT (r = 0,537; p < 0,001), e nenhuma correlação foi encontrada com o ACT (r = -0,118; p = NS). Conclusões: Estes resultados sugerem que apesar do Anti-Xa continuar a ser o método preferencial para o controlo da dose de UFH, o aPTT pode ser uma alternativa viável. Assim, sugerimos utilizar o Anti-Xa e aPTT para monitorizar a atividade da UFH e o ACT para avaliar a coagulação.

Introdução O trastuzumab deruxtecano (T-DXd) é um conjugado fármaco-anticorpo composto por um anticorpo anti-HER2, o trastuzumab, um linker clivável baseado num tetrapéptido e um inibidor da topoisomerase I, o deruxtecano. Inicialmente, o T-DXd foi aprovado em janeiro de 2021 pela EMA para tratamento de doentes adultos com cancro da mama HER2-positivo, irressecável ou metastático. Mais recentemente, em janeiro de 2023, o T-DXd foi aprovado em monoterapia para tratamento de doentes adultos com cancro da mama irressecável ou metastático HER2-low. Métodos Estudo observacional retrospetivo numa coorte de doentes com cancro da mama metastático, HER2-positivo ou HER2-low, que receberam tratamento com pelo menos um ciclo completo de T-DXd entre setembro de 2021 e maio de 2023, no centro oncológico da Fundação Champalimaud. Resultados Durante o presente estudo, foram seguidas 8 doentes tratadas com T-DXd. Todas as doentes desenvolveram pelo menos uma reação adversa durante o tratamento. As reações adversas reportadas foram neuropatia (n=6; 75%), dispepsia (n=5; 62,5%), diarreia (n=5; 62,5%), alopecia (n=4; 50%), náuseas (n=2; 25%), fadiga (n=2; 25%), pneumonite (n=1; 12,5%), mucosite (n=1; 12,5%) e tonturas (n=1; 12,5%). Conclusões A utilização do T-DXd em contexto de real-world demonstrou um perfil de segurança consistente com os resultados existentes dos ensaios clínicos. No entanto, foi detetado um novo sinal de segurança. Em 75% das doentes tratadas com T-DXd durante o estudo foi reportada neuropatia periférica. No entanto, esta reação adversa foi reportada no estudo DESTINY-Breast03 em apenas 13% dos doentes. Em suma, no presente estudo em contexto real, confirmou-se um perfil de segurança favorável utilização do T-DXd em doentes com cancro da mama HER2-positivo e HER2-low.

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa com afeção dos neurónios motores superiores e inferiores e atrofia das fibras musculares por eles inervados. Manifestações da ELA incluem fraqueza e paralisia progressivas dos músculos apendiculares, bulbares e respiratórios, alterações cognitivas e comportamentais. Não existindo tratamento eficaz para a ELA, os doentes experienciam um crescente declínio funcional, desde a imobilização progressiva à morte. Assim, ficam gradualmente dependentes do cuidado de terceiros, geralmente familiares, que atuam como cuidadores informais. À medida que a doença progride, os cuidados a prestar são mais exigentes do ponto de vista técnico, físico e mesmo emocional. Neste sentido, a atenção prestada a estas pessoas torna-se também um elemento relevante dos cuidados. Nesta perspetiva, compreender a experiência do cuidador informal da pessoa com ELA, pode permitir aos médicos uma adequação da sua prática clínica de forma a otimizar os cuidados prestados, maximizando a qualidade de vida do doente e do seu cuidador. O presente trabalho consiste numa revisão narrativa, que procurou explorar a experiência do cuidador informal da pessoa com ELA, considerando aspetos como o impacto na sua saúde, bem-estar e qualidade de vida. A pesquisa bibliográfica incluiu literatura publicada entre os anos de 1983 e 2023, na base de dados PubMed, englobando artigos de investigação, revisões sistemáticas e não sistemáticas. Consultaram-se ainda livros e websites considerados relevantes. Como complemento, realizou-se uma visita à Associação Portuguesa de Esclerose Lateral Amiotrófica. Os cuidadores informais da pessoa com ELA experienciam várias dificuldades com impacto negativo na sua saúde, bem-estar e qualidade de vida havendo, todavia, alguns estudos que reportam efeitos positivos. De forma a mitigar os efeitos negativos na saúde dos cuidadores salienta-se a importância de se refletir sobre a restruturação dos serviços médicos e sociais que devem também orientar-se para prestar apoio e acompanhamento adequado as estas pessoas.

A elevação assintomática de CK surge tipicamente associada à exposição a medicamentos, exercício físico intenso, trauma e a determinadas doenças sistémicas. No entanto, inúmeras doenças neuromusculares também se podem manifestar com hiperCKemia assintomática. Muitas destas doenças neuromusculares apresentam complicações graves e permanentes, as quais podem ser atenuadas, caso o diagnóstico e consequente tratamento (quando disponível) sejam realizados o mais precocemente possível. Muitos destes casos são pauci ou assintomáticos em idade pediátrica, surgindo os primeiros sintomas numa fase mais tardia da história natural da doença. Contudo, são passíveis de diagnóstico precoce por identificação de hiperCKemia. Na literatura existem alguns algoritmos propostos para o diagnóstico de hiperCKemia assintomática/paucissintomática. Contudo, estes não contemplam a população pediátrica, na qual um diagnóstico precoce poderá alterar o curso natural da doença. Esta Tese propõe o desenvolvimento de um algoritmo de diagnóstico de hiperCKemia assintomática/paucissintomática direcionado para a população pediátrica. Para alcançar este objetivo realizou-se uma revisão retrospetiva dos doentes com hiperCKemia assintomática/paucissintomática na unidade de Neuropediatria do Hospital de Santa Maria entre 2006 e 2020. Analisaram-se os dados demográficos, antecedentes pessoais e familiares, sintomas acompanhantes, valor máximo de CK, exame objetivo na primeira consulta, resultados de EMG, biópsia muscular e testes genéticos, diagnóstico final e follow-up. Os resultados obtidos permitiram estratificar a marcha diagnóstica, com reforço da necessidade de realização de uma anamnese cuidada, com particular atenção à história familiar. Do mesmo modo, a ordem de grandeza da elevação de CK pode ser um auxiliar na definição de hipóteses de diagnóstico. Devem ser realizados exames complementares de diagnóstico, como o EMG e, em casos específicos, a biópsia muscular. Para o estabelecimento de um diagnóstico etiológico, torna-se cada vez mais relevante a realização de testes genéticos.

In this study, event related potentials (ERPs) were used to investigate the extent to which dyslexics (aged 9–13 years) differ from normally reading controls in early ERPs, which reflect prelexical orthographic processing, and in late ERPs, which reflect implicit phonological processing. The participants performed an implicit reading task, which was manipulated in terms of letter-specific processing, orthographic familiarity, and phonological structure. Comparing consonant- and symbol sequences, the results showed significant differences in the P1 and N1 waveforms in the control but not in the dyslexic group. The reduced P1 and N1 effects in pre-adolescent children with dyslexia suggest a lack of visual specialization for letter-processing. The P1 and N1 components were not sensitive to the familiar vs. less familiar orthographic sequence contrast. The amplitude of the later N320 component was larger for phonologically legal (pseudowords) compared to illegal (consonant sequences) items in both controls and dyslexics. However, the topographic differences showed that the controls were more left-lateralized than the dyslexics. We suggest that the development of the mechanisms that support literacy skills in dyslexics is both delayed and follows a non-normal developmental path. This contributes to the hemispheric differences observed and might reflect a compensatory mechanism in dyslexics.

Two different forms of parafoveal dysfunction have been hypothesized as core deficits of dyslexic individuals: reduced parafoveal preview benefits (Btoo little parafovea^) and increased costs of parafoveal load (Btoo much parafovea^).We tested both hypotheses in a single eye-tracking experiment using a modified serial rapid automatized naming (RAN) task. Comparisons between dyslexic and non-dyslexic adults showed reduced parafoveal preview benefits in dyslexics, without increased costs of parafoveal load. Reduced parafoveal preview benefits were observed in a naming task, but not in a silent letter-finding task, indicating that the parafoveal dysfunction may be consequent to the overload with extracting phonological information from orthographic input. Our results suggest that dyslexics’ parafoveal dysfunction is not based on strict visuo-attentional factors, but nevertheless they stress the importance of extra-phonological processing. Furthermore, evidence of reduced parafoveal preview benefits in dyslexia may help understand why serial RAN is an important reading predictor in adulthood.

A presente proposta de pesquisa apresenta um projecto museológico para implementação de um museu de arte contemporânea na cidade do Rio Grande, Estado do Rio Grande do Sul, Brasil, numa parceria museu universidade comunidade. Para realização deste projecto, foram analisadas a história da cidade, além das possibilidades (económicas, políticas, sociais, etc), não esquecendo da recolha das opiniões da comunidade local, dos professores e dos alunos de artes, principais motivadores da criação de um museu. Depois de diagnosticada a possibilidade de criação de um museu de arte contemporânea na cidade, foram realizadas a escolha do edificado, sua proposta de adaptação mínima necessária, a criação de suas colecções, projecto museológico e o seu discurso dinâmico. Como forma de inserir a presente proposta na realidade museológica contemporânea, assim como perceber algumas questões relativas ao funcionamento dos museus de arte, foram brevemente analisados três casos paradigmáticos: MARGS Museu de Arte do Rio Grande do Sul Ado Malagoli (Brasil), Museu do Chiado Museu Nacional de Arte Contemporânea (Portugal) e MARCO Museo de Arte Contemporáneo de Vigo (Espanha). Este projecto pretender desenvolver e perspectivar a cultura, arte e os artistas locais, requalificar a cidade do Rio Grande e principalmente, democratizar a arte contemporânea através de um projecto museológico idealizado com a comunidade e para a comunidade local

Os bacteriófagos são das entidades biológicas mais abundantes na Terra, estimando-se que o seu número seja aproximadamente 1032. Apesar da sua abundância só em 1917 é que foram denominados como tal por Felix d’ Hérelle. O seu estudo pode ser dividido em 3 períodos, sendo o primeiro logo após a sua descoberta, aplicando-se em terapia em animais e humanos; com o surgimento dos antibióticos o interesse em fagos diminuiu tendo sido estudados ao nível da estrutura e interacções hospedeiro-fago, originando a biologia molecular; actualmente tenta-se compreender o papel destes ao nível ecológico e usar no controlo de populações bacterianas patogénicas. Uma das bactérias patogénicas é Helicobacter pylori, associada a diversas patologias ao nível da mucosa gástrica humana, o seu ambiente natural. Actualmente não existe uma colecção de fagos disponível contra este microrganismo apesar do elevado número e ubiquidade. Neste trabalho pretendeu-se o isolamento e caracterização de bacteriófagos desta espécie, tornando estes disponíveis para futuros estudos sobre a importância que estes podem ter ao nível da virulência, ecossistema e biologia deste microrganismo. Foram adoptadas várias metodologias com vista a alcançar o objectivo, iniciando-se com a pesquisa de fagos líticos em amostras ambientais, indução de profagos integrados, tendo esta indução sido feita em meio líquido e sólido, com recurso a radiação ultra violeta, mitomicina C e outros agentes descritos como indutores de profagos, observando-se por microscopia electrónica o efeito sobre as estirpes. Estes procedimentos foram feitos em paralelo com outros 2 géneros bacterianos Escherichia e Campylobacter. Por fim foi realizada uma pesquisa de profagos com recurso à técnica de PCR, usando primers específicos para sequências conservadas e descritas como pertencendo a um profago de H. pylori. Apesar de não se ter isolado e caracterizado qualquer fago de H. pylori, foi possível a sua detecção ou seus remanescentes em 20% das estirpes usadas, por PCR. No entanto a indução de profagos com radiação UV e observação por microscopia electrónica de varrimento mostrou indícios da presença de fagos líticos, contudo fica a dúvida se se trata do fenómeno de autolise programada.

A artrite reumatóide é uma doença autoimune, de etiologia desconhecida, caracterizada pela destruição, mais ou menos gradual, das articulações, podendo essa destruição estender-se até à cartilagem e ossos. Afeta sobretudo mulheres, e a sua incidência é maior com o avançar da idade. Um diagnóstico precoce e tratamento adequado são dois fatores preditivos de bom prognóstico. Os objetivos do tratamento são a redução da inflamação, alívio da dor e impedir a disfunção articular. Tal pode ser conseguido não só com tratamento farmacológico, mas também colocando em prática medidas não farmacológicas, como a prática de exercício físico regular e uma alimentação cuidada. Relativamente ao tratamento farmacológico, irá variar de acordo com a atividade da doença e manifestação de sintomas, que geralmente incluem rigidez matinal, poliartrite simétrica com envolvimento das articulações das mãos e fadiga. Habitualmente, para um controlo inicial da doença e, se possível, a sua remissão (que raramente é alcançada) são administrados, em primeira linha, antirreumatismais clássicos de que é exemplo o metotrexato, em conjunto com glucocorticoides em baixa dose, até que os antirreumatismais convencionais comecem a exercer a sua ação imunossupressora, que usualmente tem início no período de alguns meses. Em indivíduos reumáticos que se mostram intolerantes aos fármacos antirreumatismais clássicos e/ou há falha na remissão da doença, as terapias biológicas constituem, em grande parte dos casos, uma escolha eficaz. Os fármacos biológicos, de acordo com a classe a que pertencem, podem inibir a ação de citocinas próinflamatórias como o TNF-α, IL-1, Il-6 ou o CD20. Em termos práticos, atuam na redução da inflamação, através da modulação da ação dos componentes do sistema imunitário. Porém, ainda que a introdução dos medicamentos biológicos tenha representado um marco importante no tratamento da artrite reumatóide, tal como acontece com todos os fármacos, sem exceção, os biológicos vêm com as suas desvantagens, sendo o custo elevado, a administração parentérica e os efeitos secundários algumas das razões que podem limitar a sua utilização mais ampla. Neste sentido, esta monografia explora o modo como as terapias biológicas vieram alterar o paradigma do tratamento, assim como os riscos associados à imunossupressão e o futuro destas terapêuticas.

Radiotherapy-induced cardiac toxicity and consequent diseases still represent potential severe late complications for many cancer survivors who undergo therapeutic thoracic irradiation. We aimed to assess the phenotypic and paracrine features of resident cardiac mesenchymal stromal cells (CMSCs) at early follow-up after the end of thoracic irradiation of the heart as an early sign and/or mechanism of cardiac toxicity anticipating late organ dysfunction. Resident CMSCs were isolated from a rat model of fractionated thoracic irradiation with accurate and clinically relevant heart dosimetry that developed delayed dose-dependent cardiac dysfunction after 1 year. Cells were isolated 6 and 12 weeks after the end of radiotherapy and fully characterized at the transcriptional, paracrine, and functional levels. CMSCs displayed several altered features in a dose- and time-dependent trend, with the most impaired characteristics observed in those exposed in situ to the highest radiation dose with time. In particular, altered features included impaired cell migration and 3D growth and a and significant association of transcriptomic data with GO terms related to altered cytokine and growth factor signaling. Indeed, the altered paracrine profile of CMSCs derived from the group at the highest dose at the 12-week follow-up gave significantly reduced angiogenic support to endothelial cells and polarized macrophages toward a pro-inflammatory profile. Data collected in a clinically relevant rat model of heart irradiation simulating thoracic radiotherapy suggest that early paracrine and transcriptional alterations of the cardiac stroma may represent a dose- and time-dependent biological substrate for the delayed cardiac dysfunction phenotype observed in vivo.

In this study, we used event-related potentials (ERPs) to evaluate the contribution of surface color and color knowledge information in object identification. We constructed two color-object verification tasks – a surface and a knowledge verification task – using high color diagnostic objects; both typical and atypical color versions of the same object were presented. Continuous electroencephalogram was recorded from 26 subjects. A cluster randomization procedure was used to explore the differences between typical and atypical color objects in each task. In the color knowledge task, we found two significant clusters that were consistent with the N350 and late positive complex (LPC) effects. Atypical color objects elicited more negative ERPs compared to typical color objects. The color effect found in the N350 time window suggests that surface color is an important cue that facilitates the selection of a stored object representation from long-term memory. Moreover, the observed LPC effect suggests that surface color activates associated semantic knowledge about the object, including color knowledge representations. We did not find any significant differences between typical and atypical color objects in the surface color verification task, which indicates that there is little contribution of color knowledge to resolve the surface color verification. Our main results suggest that surface color is an important visual cue that triggers color knowledge, thereby facilitating object identification.

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Telomeres, the physical ends of linear eukaryotic chromosomes, are nucleoprotein structures comprising telomeric DNA, the multiprotein complex shelterin and the long noncoding (lnc) telomeric repeat-containing RNA (TERRA). These structures assemble at the end of chromosomes to avoid unwanted activation of DNA repair machineries and telomeric fusions, thus having an essential role in maintaining genome stability and cellular homeostasis. The protein complex shelterin is considered the guardian of telomere integrity. Within this complex, the telomeric double-stranded (ds) DNA binding proteins TRF1 and TRF2 are well known for their functions in supporting faithful telomeric DNA replication and chromosome end protection, respectively. Conversely, it has been shown that increased levels of TRF1 and TRF2 disturb telomere stability, indicating that association of TRF proteins with telomeric DNA has to be tightly controlled. However, the mechanisms controlling TRF protein assembly on telomeric chromatin remain to be fully elucidated. The lnc RNA TERRA also plays several functions at telomeres: it recruits several proteins and enzymatic functions to chromosome ends by acting as a scaffold molecule; it facilitates telomeric heterochromatin formation and telomere replication; and it is involved in telomere-length regulation. It is also known that TERRA binds to TRF1 and TRF2, both in vitro and in vivo, but the mechanisms regulating these interactions and their physiological relevance are fairly unexplored. Our laboratory previously showed that TRF2, through its N-terminal basic (B) domain, binds to TERRA and promotes its invasion into telomeric dsDNA. TRF2-mediated TERRA invasion leads to formation of telomeric RNA:DNA hybrids or R-loops (telR loops). We also demonstrated that the N-terminal acidic (A) domain of TRF1, when fused to TRF2 B domain, suppresses the binding of the latter to TERRA and that TRF1 inhibits TRF2-stimulated telR-loop formation. This suggests that TRF proteins communicate in order to regulate telR-loop formation in cells. Here, we further characterized the molecular mechanisms regulating the binding of TRF proteins to TERRA. We showed that the binding of both TRF1 and TRF2 to TERRA depends on the ability of this RNA to form G-quadruplex (G4s) structures. While both TRFs also bind to non-telomeric RNAs forming G4s, the binding to TERRA was more efficient. Additionally, we demonstrated a critical role of charged amino acids within the N-terminal domains of TRFs in TRF1-mediated regulation of TERRA-TRF2 B domain interactions. We also started to characterize TERRA binding sites outside the N-terminal domains of TRFs and showed that multiple domains within both TRF1 and TRF2 can bind to TERRA. We then demonstrated a role of TERRA in the regulation of TRFs association with telomeric dsDNA. TERRA overexpression in human cancer cells reduced the density of TRF proteins at telomeres and affected telomere integrity, as indicated by an increase in telomere fragility and loss of telomeric tracts. These phenotypes seemed to be directly associated to the reduction of TRF1 density at telomeres elicited by TERRA as they were no longer observed in cells with ectopic overexpression of TRF1. Based on these data, we propose a model where TERRA-mediated regulation of TRFs density at telomeres is crucial for telomeric DNA repair and elongation. This model challenges the current understanding of telomere structure and organization, which considers shelterin and TERRA as separate entities, and depicts a novel view of telomeres as dynamic DNA/RNA/protein particles where TERRA is a key regulator of shelterin association with telomeric DNA. Overall, this work highlights the importance of TERRA-TRF interactions in supporting regulated telR-loop formation and telomere stability, and, in turn cellular and tissue homeostasis, thereby avoiding disease conditions.

At a time when humans are positioning themselves as a major geological force on Earth, the unprecedented environmental consequences and reactions are leaving humanity powerless and in considerable uncertainty about the future of the planet and its ways of life. This artistic investigation consider modernization as a phenomenon of intoxication of natural and urban space. A burden that has become too present, that is now alienating the condition of many ways of life on Earth, including the human one, forcing the modification of behaviours, lifestyles and thoughts. What modifications are taking place in the way we view this phenomenon, especially among contemporary artists and others actors in the visual arts. How does the Anthropocene influence the representation of our society in contemporary art? While the dominant aesthetic has always been driven and succeeded by fashion movements, or rather strong widespread influences, we see, in contemporary art and dominant urban culture, an alienated aesthetic, constantly shifting towards a hybrid reality. The border between science fiction and the near future is becoming very ambiguous. It presents a set of personal works created between 2020 and 2022, addressing in a personal way the issues related to the impacts of the Anthropocene on the landscape. The consequences are concretely palpable today; in our flora and fauna, for example, which have already initiated strange mutation processes

Neural stem cells (NSCs) are found in discrete regions of the adult mammalian brain, the so called neurogenic niches. These niches are localized in the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles and in the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). During adulthood, NSCs present the capacity of self-renewal, proliferation and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes, making them a powerful tool to treat disease-related neural loss. Several efforts have been made to elucidate the mechanisms involved in NSC fate regulation. Importantly, mitochondria are at the center of these findings. In fact, several studies suggest that these organelles have an important role in regulating NSC differentiation and lineage determination. Impairments in mitochondrial dynamics and metabolism were shown to negatively impact on NSC properties. Nevertheless, a major aspect that remains unclear is whether mitochondrial dynamics and metabolism have a role in directing NSC fate towards neuronal, oligodendroglial and astroglial lineages. Therefore, this PhD thesis aimed to dissect how mitochondria biogenesis, fusion/fission cycles, morphology and bioenergetics are involved in NSC differentiation. To address these questions, we used the NSA model which is an in vitro model widely used to evaluate the NSC properties. For this, NSCs were obtained by isolating SVZ and DG cells from P1-3 C57BL/6 mice. The isolated cells were grown in neurospheres, and consequently passaged to guarantee higher yields of NSCs. Thereafter, neurospheres were plated under specific differentiation conditions giving rise to a mixed culture composed of immature cells and of neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Through the NSA, we demonstrated that the neurospheres are mainly composed by NSCs, and that these cells present self-renewal, proliferation and differentiation capacities. Additionally, SVZ-derived NSCs have a higher proliferative capacity compared to DG-derived NSCs. Having a suitable model to study NSC fate, we then investigated the role of mitochondrial dynamics during NSC differentiation, by assessing the levels of proteins involved in mitochondrial biogenesis and fusion/fission cycles in SVZ cells from passage 0 (P0) to P2 and in DG cells at P1-P2. Importantly, with this analysis we could also analyse whether the neurosphere passage interfere with the expression of those proteins. Overall, expression of mitochondrial biogenesis-related proteins did not significantly change with NSC differentiation, in both neurogenic niches. Importantly, the levels of proteins involved in mitochondrial fusion such as Mitofusin (Mfn) 1 and 2 significantly increased while proteins involved in fission namely dynamin-related protein 1 (DRP1) significantly decreased along differentiation, independently of mitochondrial mass alterations, in SVZ cells at P2. To further comprehend the fusion/fission cycles in the SVZ cells at P2, mitochondrial morphology was evaluated in both NSCs and differentiated cells, using the Mitochondrial Network Analysis (MiNA) macro. Mitochondrial number, length and area differed in the different cell types. Mitochondrial number significantly increased during astroglial and neuronal differentiation. Moreover, both NSCs and oligodendrocyte precursor cells presented a more elongated mitochondria, compared to the other cells. Interestingly, mitochondrial area did not change in neuronal cells, increased significantly during astrocytic differentiation while there was a significant reduction along oligodendroglial maturation. Since mitochondrial dynamics are at a certain extent linked to mitochondrial bioenergetics, the differences obtained could be due to differences in the metabolic profile. Therefore, we then decided to explore the bioenergetic profile during NSC differentiation, and between cells from different lineages, in SVZ cells obtained from tertiary neurospheres dissociation. To sort astrocytes, oligodendrocytes and neurons, magnetic-activated cell sorting was used. We observed that with differentiation the cells seem to become more reliant on oxidative phosphorylation. Although neurons presented a significantly lowest basal respiration, these cells are the most energetically flexible cells. In addition to this, neurons presented a similar respiratory profile when compared with the control mixed population of cells. Altogether, the data herein contribute to further elucidate the role of mitochondrial dynamics during NSC differentiation, reinforcing the metabolic differences throughout this process and within cell lineages. These findings will serve as a groundwork to direct NSC fate by modulating mitochondrial properties, which in the future can lead to the development of therapeutic targets for the regeneration of the Central Nervous System (CNS).

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O fígado é um órgão de enorme importância fisiológica e metabólica. Os hepatócitos, que constituem cerca de 80% da massa total de fígado, são frequentemente expostos a agentes tóxicos podendo levar à sua perda, limitando a função hepática 1. Apesar da capacidade regenerativa destas células, o recurso ao transplante de fígado é frequente, no entanto, o número de dadores disponíveis é um factor limitante desta terapia. Os hepatócitos primários humanos e dispositivos hepáticos bioartificiais (BAL) podem ser utilizados como alternativa terapêutica. Porém, a reduzida capacidade proliferativa ex vivo dos hepatócitos, a perda do perfil de expressão hepática e da sua funcionalidade limitam o seu potencial terapêutico, aquando mantidos em cultura ao longo do tempo 2. Estas células possuem ainda um enorme potencial no desenvolvimento de novos modelos in vitro para ensaios pré-clínicos, na descoberta de novos fármacos e em testes toxicológicos. Em terapias hepáticas têm sido utilizadas fontes alternativas de células do fígado, nomeadamente, progenitores hepáticos (com capacidade de maturar em hepatócitos e colangiócitos, as principais células presentes no fígado), células estaminais da medula óssea e células estaminais embrionárias (CEEs). Apesar de todas estas fontes alternativas apresentarem limitações na produção de hepatócitos, as células estaminais embrionárias humanas (CEEhs) são consideradas uma potencial fonte ilimitada de células com uma enorme aplicabilidade neste tipo de terapias. Vários estudos têm mostrado a capacidade destas originarem células com características hepáticas3,4. Os processos de diferenciação hepática a partir de CEEhs reflectem o desenvolvimento do fígado in vivo, onde, numa primeira fase, as CEEhs originam células de endoderme definitiva (ED). Estas por sua vez diferenciam-se em progenitores hepáticos que maturam dando origem aos hepatócitos adultos. Têm sido desenvolvidos protocolos que visam melhorar as condições de cultura com posterior optimização da diferenciação, tais como o recurso a factores de crescimento essenciais para a diferenciação ou ao uso de uma matriz extracelular (MEC), que constitui uma rede de macromoléculas que influencia a migração, a polarização e, consequentemente, a funcionalidade das células. Contudo, estes protocolos apresentam duas grandes desvantagens: (1) o número de hepatócitos produzidos a partir de CEEhs durante o processo de diferenciação é insuficiente para posterior aplicação em BAL (para o qual são necessários 10 mil milhões de hepatócitos) e (2) o tipo de células obtido no final da diferenciação não revela um fenótipo caracteristico de hepatócitos maduros, apresentando uma população altamente heterogénea de células indiferenciadas, progenitoras e com carácter maduro. Portanto, o processo de diferenciação hepática necessita de ser optimizado, de modo a aumentar significativamente o rendimento de hepatócitos funcionais e a pureza da população obtida no final do mesmo. Numa perspectiva de optimização, a monitorização de todo o processo de diferenciação é essencial para caracterizar e identificar as células específicas de cada etapa do mesmo, permitindo deste modo avaliar de forma precisa a sua eficiência. Actualmente, as técnicas existentes para esta caracterização são invasivas, morosas e inadequadas quando se pretende definir da melhor forma a optimização do bioprocesso. Como alternativa têm sido desenvolvidas estratégias para modificar geneticamente as CEEhs, como por exemplo, o uso de genes repórter fluorescentes, para marcar especificamente um determinado tipo celular proveniente de CEEhs. A introdução destes genes fluorescentes, sob o controlo de promotores específicos de cada tipo celular torna possível essa marcação específica, tirando partido de técnicas não-invasivas. Um dos genes repórter mais utilizado é a variante da proteína verde fluorescente (eGFP; do inglês, enhanced Green Fluorescent Protein). Ultimamente, têm sido publicados alguns estudos que utilizam esta técnica para identificar e isolar uma linhagem derivada de CEEhs. Apesar da utilidade desta técnica na optimização do processo de diferenciação, continua a ser necessário o desenvolvimento de uma estratégia que monitorize em tempo-real todas as etapas deste processo. Tendo em conta as etapas cruciais durante o desenvolvimento do fígado, é possível visualizar e acompanhar todo o processo recorrendo à expressão de dois genes repórter, controlados por diferentes sequências reguladoras específicas de cada etapa do desenvolvimento. Os métodos mais utilizados para transferência génica são os vectores virais, em particular os vectores lentivirais (VLs) baseados no Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH), devido à sua eficiência na transferência génica e expressão estável ao longo do tempo. Estes vectores demonstram também maior resistência ao silenciamento em CEEs, comparativamente aos restantes vectores virais, sendo uma poderosa ferramenta na transferência génica nestas células. Assim, foram desenvolvidos vectores lentivirais inactivados (SIN; do inglês, Self-Inactivating), caracterizados por possuirem uma delecção na região U3 da longa repetição terminal a 3‟ (LTR; do inglês, Long Terminal Repeat) de modo a que a expressão do genoma viral na célula hospedeira seja controlada apenas pelos promotores exogenos, que controlam a expressão dos genes repórter, levando à perca da capacidade replicativa dos vectores lentivirais e tornando-os deste modo seguros. Neste contexto, desenvolveu-se uma nova ferramenta baseada na construção de vectores lentivirais inactivados duplo-repórter (VLs-SIN), que contém dois genes repórter, Cherry e eGFP, controlados por promotores independentes que permitem a monitorização em tempo-real das principais etapas. Inicialmente, para comprovar a presença de duas unidades transcripcionais independentes no sistema desenvolvido, foram clonados dois promotores constitutivos para regularem a expressão dos dois repórteres. A expressão de cada repórter é controlada apenas pelo promotor a montante do mesmo, evidenciando uma expressão independente. Por outro lado, uma célula que ostenta o vector duplo, com os dois genes repórter a serem transcritos por dois promotores independentes mas activos no mesmo espaço temporal (neste caso, promotores de genes constitutivos), co-expressa os dois genes fluorescentes. Após a validação inicial deste sistema e com a produção dos VLs-SIN, a clonagem suplementar de sequências de poliadenilação (uma sequência de poliadenilação sintética seguida de uma sequência espaçadora não codificante) entre as duas unidades transcripcionais levou à optimização do nível da expressão dos dois repórteres, diminuindo a variação da expressão de ambos, quando expressos constitutivamente na população genéticamente modificada. Por outro lado, a desvantagem apresentada pela proteína vermelha fluorescente DsRED em relação às proteínas vermelhas fluorescentes monoméricas, como por exemplo a mCherry, levou-nos à substituição do gene repórter DsRED pelo gene que codifica a proteína mCherry. Esta proteína apresenta uma maior foto-estabilidade, sendo um factor crítico na monitorização ao longo do tempo. No entanto, apesar da diminuição da expressão deste repórter em relação ao nível de expressão apresentado pela DsRED, a conjugação dos repórteres mCherry e eGFP no sistema duplo-repórter mostrou ser a mais promissora. Assim, foram desenvolvidos três VLs-SIN duplo-repórter (mCherry e eGFP) para transferência génica de marcadores específicos das etapas cruciais do processo de diferenciação hepática. Os promotores clonados mostraram especificidade e eficácia na expressão dos repórteres durante o processo de validação numa linha celular de hepatocarcinoma humano HepG2. Esta linha celular é normalmente utilizada como modelo in vitro em estudo de metabolismo de hepatócitos humanos devido à sua capacidade de expressar genes hepáticos fetais. Os resultados obtidos demonstram a capacidade desta nova ferramenta em caracterizar e identificar as células específicas de cada etapa da diferenciação de CEEhs em hepatócitos. Este sistema poderá permitir a monitorização da diferenciação numa linhagem específica, e de uma forma mais eficaz a optimização de todas as condições de cultura para expansão e diferenciação. Por outro lado, esta nova ferramenta desenvolvida mostrou-se promissora quanto à posterior aplicação em estudos do perfil de expressão génica para monitorizar a resposta a determinados estímulos. Assim, este estudo contribuirá futuramente para o progresso no campo da biologia das células estaminais e sua aplicabilidade.