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Emerging pollutants such as pharmaceuticals are continuously released to aquatic environments posing a rising threat to marine ecosystems. Yet, monitoring routines and ecotoxicity data on biota worldwide for these substances are lacking. Non-steroidal anti-inflammatory drugs are among the most prescribed and found pharmaceuticals in aquatic environments. The toxicity effects of environmentally relevant concentrations of ibuprofen on primary productivity, oxidative stress and lipid metabolism of the diatom Phaeodactylum tricornutum were assessed. Diatom cultures were exposed to 0, 0.8, 3, 40, 100 and 300 μg L-1 ibuprofen concentrations, usually found in the vicinity of wastewater treatment plants and coastal environments. Higher concentrations (100 and 300 μg L-1) had a negative impact in P. triconutum growth, inhibiting the chloroplastic energy transduction in the electron transport chain resulting in lower energy reaching the PS I (r2 = -0.55, p < 0.05). In contrast, the mitochondrial electron transport and available energy increased (r2 = 0.68 and r2 = 0.85, p < 0.05 respectively), mostly due to enhancements in lipid and protein contents as opposed to reduction of carbohydrates. A general up-regulation of the antioxidant enzymes could contributed to alleviate oxidative stress resulting in the decrease of lipid peroxidation products (r2 = 0.77, p < 0.05). Canonical analysis of principal components was performed and successfully discriminated exposure groups, with optical data excelling in classifying samples to different ibuprofen concentrations, being potentially used as environmental indicators. Finally, the identified mild to severe effects of ibuprofen on diatoms are likely to be exacerbated by the sustained use of this drug worldwide, underpinning the urgency of evaluating the impacts of this pharmaceutical on coastal and marine trophic webs.

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Angelman syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disorder with no cure, characterized by a severe developmental delay, speech impairment, motor dysfunction, and a characteristic happy behavior. AS is caused by the loss of functional UBE3A protein, an E3 ubiquitin ligase that targets proteins for degradation by the ubiquitin-proteasome system. Disruption of UBE3A activity in neurons impairs ubiquitination leading to accumulation of UBE3A-specific targets which results in neuronal dysfunction. The UBE3A gene undergoes tissue-specific genomic imprinting, an epigenetic phenomenon that leads to parent-of-origin-specific monoallelic expression. Thus, UBE3A is exclusively expressed from the maternally inherited allele in mature neurons, since the paternal allele is silenced upon neuronal differentiation due to transcriptional interference of an antisense RNA called UBE3A-ATS. Loss of maternal UBE3A allele results in complete absence of UBE3A protein ultimately leading to AS. Most of what we know about AS has been studied in animal models, however, this pre-clinical model has several limitations for direct translation to the human disease. Recently, somatic cell reprogramming technology and neuronal differentiation protocols have contributed to overcome such difficulty and establish in vitro models using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). These models enable the generation of disease-relevant cells in limitless amounts while faithfully recapitulating neuronal developmental hallmarks, which allows the detailed elucidation of the disease mechanisms responsible for the clinical features observed in patients. In this project, we submitted healthy control and AS-derived iPSCs to a neuronal differentiation protocol for 80 days to obtain fully mature neurons. Our data suggest AS-derived neuronal cultures display increased neuronal apoptosis, enhanced gliogenesis and persistence or progenitor-like neural rosettes at the final stages of differentiation. We hypothesize that loss of UBE3A function impairs neuronal viability and consequently prompts neural progenitors to continue proliferating and differentiating, causing a precocious neuro-to-glia switch. Our results show the suitability of patient-derived iPSCs to be used as a disease modelling approach to study Angelman syndrome and future works will use this system to tackle the pathophysiological mechanisms at the molecular level that causes AS.

Um dos avanços médicos de maior sucesso na história da medicina moderna é, sem dúvida, a vacinação, que tem contribuído enormemente para a saúde humana e animal nos últimos 200 anos. No entanto, ainda enfrentamos muitas doenças para as quais nenhuma vacina eficaz ou segura pôde ser desenvolvida. A compreensão de como o sistema imunitário pode ser modulado para um tipo específico de resposta e como desenvolver estratégias imunomoduladoras para direcionar a localização específica de linfócitos são desafios atuais em imunologia. A conjugação de antigénios com ligandos de recetores de reconhecimento de padrões (PRR) é uma estratégia promissora para a modulação da imunidade específica e o TLR2 tem emergido como um recetor-chave para a indução de imunidade na mucosa. Nos últimos anos, o nosso grupo de investigação desenvolveu um sistema de clonagem em Escherichia coli para produzir antigénios em fusão com um ligando de TLR2, a lipoproteína OprI. Neste projeto, investigámos se a ativação TLR2 em células dendríticas (DCs) por OprI, sozinha ou combinada com outros estímulos, pode ser usada para determinar o tropismo de imunidade específica para a mucosa. A capacidade que as DCs de mucosa apresentam para induzir a localização de linfócitos na mucosa intestinal resulta da sua capacidade em converter vitamina A em ácido retinóico. Este processo depende da atividade de enzimas aldeído desidrogenase (ALDH), as quais são expressas em níveis baixos nas DCs extra-mucosa. Por PCR quantitativo em tempo real, observámos que a OprI induz a expressão de Aldh1a2 em DCs que não são de mucosa e mostramos, através de ensaios de Aldefluor, que esta expressão se traduz numa atividade ALDH funcional. Demonstramos ainda, através da co-cultura ex vivo de DCs de baço de ratinhos C57BL/6 com células T CD4+ específicas para ovalbumina (OVA) obtidas de ratinhos OT-II RAG2-/-, que a estimulação de células dendríticas com OprI converte de forma efetiva a vitamina A num sinal que imprime nas células T ativadas os recetores de tropismo para mucosa CCR9 e α4β7. Quando usada como adjuvante, a lipoproteína OprI induz um perfil Th misto e experiências preliminares desenvolvidas pelo nosso grupo mostraram que a sua associação com MPLA (um ligando de TLR4) é uma estratégia promissora para ativar DCs com potencial polarizador Th1. Através da estimulação ex vivo de DCs de baço de ratinho e de co-cultura com células OT-II, podemos confirmar, por ELISA de IFN-γ, o favorecimento de uma polarização Th1 induzido pela combinação de OprI com MPLA. Mais importante, os ensaios de Aldefluor e a avaliação por citometria de fluxo da expressão superficial dos recetores CCR9 e α4β7 nas células OT-II em co-cultura mostram que a OprI, quando combinada com MPLA, não perde a capacidade de equipar as DCs com propriedades indutoras de respostas de mucosa. Os nossos resultados evidenciam a OprI como um adjuvante promissor para indução de respos tas imunitárias na mucosa intestinal desencadeadas por inoculação parentérica. Estas descobertas poderão contribuir para o desenvolvimento de vacinas mais eficazes contra agentes patogénicos que utilizam a mucosa intestinal como porta-de-entrada no organismo.

The flower thrips Frankliniella occidentalis (Pergande), the leaf-dwelling thrips Echinothrips americanus Morgan and the most recent thrips invader Thrips setosus Moulton are currently amongst the most concerning pests in Dutch greenhouses. Although F. occidentalis is now successfully controlled by generalist predators of the genus Orius in vegetable crops, E. americanus and T. setosus still lack an efficient biological control agent, especially in ornamental crops where these pests are particularly problematic. In the first part of this study, we evaluated the predation capacity, predation behaviour, prey preference and life history traits of the two commercial anthocorid predators, Orius laevigatus (Fieber) and Orius majusculus (Reuter) on these key pests, in laboratory trials at 25 °C. Female adults of O. laevigatus and O. majusculus fed on 18 and 20 F. occidentalis adults, 30 and 42 E. americanus adults and 36 and 38 T. setosus adults per day, respectively. Complementarily, we observed that F. occidentalis showed a very agile behaviour in contrast to the low mobility levels observed for T. setosus and E. americanus. This suggests that prey’s mobility was one of the factors influencing the predation capacity of Orius. All development and reproductive parameters were more favourable on the prey E. americanus, including intrinsic rates of increase, averaging 0.1662 and 0.1538 females/female/day for O. laevigatus and O. majusculus, respectively. Additionally, slightly superior fecundities and longevities were scored by O. laevigatus in comparison to O. majusculus. Overall O. laevigatus reared on E. americanus had the best performance with values of fecundity (169 eggs/female), longevity (23.6 days for females) and intrinsic rate of increase, approaching what has previously been reported on the high-quality prey Ephestia kuehniella Zeller eggs. Contrastingly, O. majusculus reared on F. occidentalis registered an inferior performance with the lowest intrinsic rate of increase (0.1320). Regarding the second part of the study, we investigated the effects of supplemental foods on life history traits of T. setosus. This species has been recently introduced in Europe and little is known about its biology. We found that the addition of E. kuehniella eggs, Artemia franciscana Kellogg cysts, pollen or honey to a bean leaf did not influence the oviposition rate or longevity of T. setosus females. We thus conclude that these common commercial foods can be used to benefit populations of natural enemies without the risk of at the same time increasing densities of T. setosus. So far, this species have not shown omnivorous habits. Additionally, based on progeny production of unmated adult females we conclude that T. setosus reproduces through haplodiploid arrhenotoky (unfertilized eggs produce haploid males and fertilized eggs produce diploid females). Altogether our findings add to the understanding of the reproductive biology and feeding habits of this unstudied species. Furthermore, we show evidence of the potential of O. laevigatus and O. majusculus as biological control agents of F. occidentalis, E. americanus and T. setosus. Particularly, we discuss E. americanus as a high-quality prey for Orius.

Confronted with the centrality of the body for trans-masculine individuals interviewed in the United Kingdom and Portugal, we explore how bodily-reflexive practices are central for doing masculinity. Following Connell’s early insight that bodies needed to come back to the political and sociological agendas, we propose that bodily-reflexive practice is a concept suited to account for the production of trans-masculinities. Although multiple, the journeys of trans-masculine individuals demonstrate how bodily experiences shape and redefine masculinities in ways that illuminate the nexus between bodies, embodiments, and discursive enactments of masculinity. Rather than oppositions between bodily conformity to and transgression of the norms of hegemonic masculinity, often encountered in idealizations of the medicalized transsexual against the genderqueer rebel, lived bodily experiences shape masculinities beyond linear oppositions. Tensions between natural and technological, material and discursive, or feminine and masculine were keys for understanding trans-masculine narratives about the body, embodiment, and identity.

Em todo o mundo, são diagnosticados anualmente 1.8 milhões de casos de cancro colorretal, uma doença consideravelmente heterogénea e em muitos casos fatal. Este tipo de cancro divide-se em vários subgrupos sendo que um deles se caracteriza pela instabilidade de microssatélites, localização do tumor no cólon proximal, pólipos com morfologia serreada, metilação frequente de ilhas CpG, mutações no gene BRAF e sobreexpressão de RAC1B. A expressão de RAC1B resulta de um processo de splicing alternativo do gene RAC1, uma pequena GTPase com um papel importante no controlo de várias vias de sinalização celular. A existência de vários locais de splicing nos pré-mRNAs permite a existência de processos de splicing alternativo para além do constitutivo, ou seja, a partir do mesmo mRNA percursor, diferentes exões ou intrões podem ser incluídos ou excluídos do mRNA final, levando, por exemplo, à produção de diferentes isoformas de determinada proteína. Este mecanismo envolve as sequências consenso que são reconhecidas pela maquinaria de splicing, mas também a ação de proteínas trans que interagem com elementos cis presentes no RNA, atuando como repressoras ou ativadoras para os diversos tipos de splicing alternativo. A variante RAC1B resulta da inclusão de um exão alternativo no mRNA maduro do gene RAC1. Este denomina-se exão 3b, possui 57 nucleótidos que se traduzem em 19 aminoácidos adicionais na proteína resultante, e confere a esta variante diferentes propriedades relativamente a sinalização celular. A regulação da proteína RAC1 é feita através de vários fatores que modulam o seu estado de ativação pela ligação a GTP ou GDP e que, consequentemente, afetam a sua localização e atividade. Sabe-se que a regulação de RAC1B é semelhante, mas esta isoforma tem uma menor afinidade para GDP, menor capacidade de hidrolisar GTP e incapacidade para interagir com inibidores de dissociação de GDP, o que resulta numa predominância desta proteína nas células na sua forma ativa. Apesar de o processo de splicing alternativo ser comum a todas as células, a sua desregulação está muitas vezes associada ao desenvolvimento de doenças. A sobreexpressão de RAC1B, para além de associada a este subtipo de cancro colorretal onde promove a sobrevivência das células tumorais e a sua progressão no ciclo celular, foi também identificada em cancro pancreático, da mama, do pulmão e da tiroide. Esta proteína poderá então ser um alvo terapêutico para o tratamento de pacientes com algumas formas de cancro, o que enaltece a importância do estudo da sua regulação nas células humanas. Tendo em conta que os processos de splicing são modulados por diferentes proteínas, é importante identificar e descrever aquelas que influenciam a expressão de RAC1B neste contexto. Os fatores SRSF1 e SRSF3 foram previamente descritos na literatura como moduladores do splicing de RAC1B em cancro colorretal, uma vez que SRSF1 promove a inclusão do exão 3b e SRSF3 promove a sua exclusão. Foram também identificadas regiões no pré-mRNA do gene RAC1 que são necessárias à ligação destes fatores, o que permitiu conhecer melhor os mecanismos de regulação deste processo. Mais recentemente, várias outras proteínas têm sido descritas como sobreexpressas em diferentes tipos de cancro, bem como capazes de influenciar a expressão de RAC1B em vários tipos de células. Para este trabalho as proteínas RANBP2, PTBP1, ESRP1, DIS3L2 e hnRNP U foram selecionadas como objeto de estudo, sendo o primeiro objetivo deste trabalho a descrição da sua influência na inclusão ou exclusão do exão 3b de RAC1 em células colorretais. Com esta finalidade, procedeu-se a experiências de sobreexpressão destas proteínas, mas também à depleção da sua expressão endógena em duas linhas celulares colorretais, uma não tumorigénica (NCM460) e uma maligna com sobreexpressão de RAC1B (HT29). Os efeitos das referidas experiências foram verificados através de RT-PCR e Western blot, quantificando-se a expressão de RAC1B relativamente à expressão de RAC1 em cada uma das condições. A depleção da nucleoporina RANBP2 levou a um aumento da expressão de RAC1B relativamente a RAC1 em células NCM460, tanto ao nível do RNA como da proteína, tendo-se verificado também este aumento em células HT29, mas apenas em relação a expressão proteica. Estes resultados indicam que a RANBP2 provavelmente atua como inibidora da inclusão do exão 3b em RAC1. Contudo, não foi possível confirmar estas observações através das experiências de sobreexpressão, visto que esta não teve efeitos significativos na expressão de RAC1B, excetuando em NCM460 onde levou a um aumento ao nível da proteína, o que contradiz os resultados acima descritos. A sobreexpressão dos quatro fatores de splicing em estudo não permitiu retirar conclusões acerca do seu efeito na inclusão ou exclusão do exão 3b no mRNA maduro do gene RAC1, contudo as experiências de depleção tiveram maior sucesso. Relativamente a PTBP1, a sua depleção provocou uma diminuição da expressão de RAC1B relativamente a RAC1 em ambas as linhas celulares utilizadas, detetável tanto por RT-PCR como por Western blot, indicando que esta proteína atua como promotora da inclusão do exão 3b de RAC1. Para o fator de splicing ESRP1, após depleção em células NCM460 houve também diminuição dos níveis de RAC1B relativamente a RAC1 ao nível do transcrito. Tanto ao nível da proteína em NCM460, como nas mesmas experiências em HT29, os resultados obtidos mostraram seguir a tendência de diminuição da inclusão do exão 3b, contudo, não foram considerados estatisticamente significativos. Concluiu-se então que este fator possivelmente também atua como promotor de RAC1B. Em relação a DIS3L2, em NCM460, apesar de os resultados não serem estatisticamente significativos, verifica-se uma tendência para a diminuição da expressão de RAC1B, enquanto que em HT29 há um aumento significativo da expressão desta variante ao nível da proteína, sendo que ao nível do transcrito, apesar de haver uma variação menor, se confirma esta tendência. Neste caso, a DIS3L2 parece promover a inclusão do exão alternativo 3b em células NCM460, mas inibi-lo em células HT29. Finalmente, a depleção de hnRNP U levou a uma diminuição da expressão de RAC1B relativamente a RAC1 em ambas as linhas celulares, não sendo estatisticamente significativo apenas o resultado ao nível da proteína em NCM460, indicando que hnRNP U atua como promotor da expressão de RAC1B. O segundo objetivo deste trabalho consistia na identificação de locais de ligação dos fatores PTBP1 e ESRP1 ao pré-mRNA do gene RAC1. Para isto, procedeu-se à mutagénese de dois possíveis locais de ligação da proteína ESRP1, previamente descritos na literatura, num minigene contendo a região entre os exões 3 e 4 do gene em questão. A mutação dos locais pretendidos no intrão 3b do minigene foi confirmada através de sequenciação do DNA, mas não foi possível proceder à subclonagem dos fragmentos mutados no minigene original, de modo a prevenir a introdução de mutações indesejadas. No futuro deve proceder-se da mesma forma na introdução de mutações em possíveis locais de ligação do fator PTBP1, e poderá sequenciar-se os plasmídeos mutados, como estratégia alternativa à subclonagem, sendo que cada minigene mutado pode depois ser transfetado juntamente com o fator em estudo, ESRP1 ou PTBP1, de modo a investigar se a expressão de RAC1B nas células se altera em relação à transfeção de um minigene não mutado juntamente com o mesmo fator. Concluindo, com este trabalho foi possível demonstrar que as proteínas RANBP2, PTBP1, ESRP1, DIS3L2 e hnRNP U estão envolvidas na regulação do splicing alternativo de RAC1 em células colorretais. Resultados preliminares indicam que RANBP2 inibe a inclusão do exão 3b em RAC1, enquanto que PTBP1, ESRP1 e hnRNP U promovem a sua inclusão. Relativamente ao fator de splicing DIS3L2, parece ter diferentes efeitos dependendo da linha celular utilizada, podendo promover ou inibir a expressão de RAC1B. Estudos futuros deverão ser realizados, de modo a consolidar estes resultados, esclarecer as vias moleculares através das quais a nucleoporina RANBP2 afeta a expressão de RAC1B e definir locais de ligação dos fatores de splicing em estudo, no pré-mRNA do gene RAC1. Estes conhecimentos poderão ser úteis para o desenvolvimento de novas terapias para pacientes com este subtipo de cancro colorretal, que inibam especificamente as vias que afetam a inclusão do exão 3b, de modo a restaurar a normalidade da sinalização celular.

Drawing on a qualitative study on migrant men recently arrived in Portugal, this paper examines how the experience of migration leads to the rebuilding of masculinity. The experiences of discrimination and strategies of resistance are linked to the history of Portuguese colonialism and the ways men hailing from contrasting colonial and postcolonial geographies within the Portuguese Empire (Brazil, Mozambique and Cape Verde) discover their subordination in the Portuguese context. We advance two central ideas. Firstly, we engage in an active historicisation of transnationalism and defend the postcolonial character of migrant masculinities. Rather than neutral or a-historical, transnational experiences of migration are better interpreted through the lens of specific histories of colonialism and postcolonialism. Secondly, while recognising the centrality of the hegemonic model of masculinity, we argue that the conceptualisation of masculinity as a complex structure of material and symbolic capitals permits to avoid one-dimensional accounts of subordination and dominance. Furthermore, the notion of capital is helpful for tying together the micro-enactments of masculinity and the macro-historical dynamics of colonialism and postcolonialism. Expanding the notion of postcolonial masculinities implies working with renewed tools suited for analysing how subordination is perpetuated through colonial devaluation or contested via the mobilisation of certain capitals.

Dada a crescente complexificação das organizações educativas e, consequentemente, dos seus sistemas de informação, verifica-se a necessidade de encontrar uma resposta que permita assegurar uma política de informação cujos procedimentos, relacionados também com a criação dos documentos enquadradores, passam pela tomada de decisão sobre os custos da implementação da política definida e a melhor adequação às necessidades presentes e futuras da organização, preservando autenticidade, integridade, fidedignidade, inteligibilidade e usabilidade da informação criada ou gerida, considerando-se uma visão integrada do Sistema de Informação. A formulação da questão de investigação: De que forma o sistema de informação do Agrupamento de Escolas de Mem Martins (AEMM) pode acrescentar valor organizacional? fundamenta a definição dos objetivos que suportam o propósito deste estudo. Por um lado, como primeiro objetivo visa-se proceder à caracterização da unidade orgânica e, no momento sequencial, avaliar o contributo do sistema de informação para a valoração organizacional no contexto da modernização administrativa da unidade orgânica e unidades educativas que a integram. As questões contempladas são abordadas de modo sistémico, de acordo com uma análise crítica e reflexiva sobre o Sistema de Informação do AEMM, justificando a opção pelo método do estudo de caso (de modo a permitirá a confirmação das hipóteses formuladas sustentada na reunião de evidências e tratamento dos dados) complementado pelo enquadramento teórico baseado em diferentes abordagens de sistemas e de organizações (estudo orgânico-funcional), com a análise dos fluxos de informação, gestão documental e, com o fim último, do contributo para a definição da política de informação (e das subsequentes dimensões), que venha a ser mais um auxiliar para a melhoria na prestação de serviço informacional da organização. A apropriação do enquadramento teórico é acompanhada pela análise de documentos que fazem o respetivo enquadramento normativo produzido por entidades públicas, organismos e tutela na área da Educação com o objetivo de criar um instrumento de trabalho passível de ser aplicado posteriormente em casos que se detetem insuficiências na definição e/ou concretização de cada um dos níveis de execução anteriormente enunciados. Com a realização do presente estudo procura-se, dar um contributo para potenciar a eficácia e eficiência na gestão de um Sistema de Informação, que se verifica não estar formalmente organizado, suportado numa Gestão Documental que progressivamente introduza procedimentos que proporcionem a modernização dos serviços e a valorização de ambas as dimensões (eficácia e eficiência) para a constante melhoria no atendimento às necessidades dos clientes (alunos, encarregados de educação e, comunidade educativa), nomeadamente através da implementação de processos de negócio na gestão documental.

A perda de sensibilidade na zona da pinça do primeiro e segundo dedos causa um importante deficit funcional com grande impacto na qualidade de vida do doente e capacidade de trabalho manual. As transferências nervosas sensitivas cada vez mais são utilizadas para “re-inervar” a face volar destes dedos, com resultados variáveis. Visando a otimização dos resultados e redução do tempo de reinervação, levantou-se a hipótese de se efetuar uma transferência do Ramo Superficial do Nervo Radial (RSNR) para os ramos sensitivos terminais do nervo mediano, distalmente na mão. Para verificar a compatibilidade entre os referidos nervos, foi levado a cabo um estudo de disseção e microdissecção detalhado dos ramos terminais do RSNR – SR1, SR2 e SR3, de dorsal para volar - num membro superior (amostra reduzida devido aos constrangimentos da pandemia COVID-19) e foram colhidas secções nervosas para análise histomorfométrica. A distância entre o Processo Estiloide do Rádio (PER) e o ponto de emergência do RSNR foi de 90 mm (42% do comprimento do antebraço) e entre o PER e a primeira divisão do RSNR de 69 mm (32% do comprimento do antebraço). Entre o PER e as bifurcações do tronco comum SR1-SR2 e do ramo SR2 foram medidos 0 e 20 mm (9% do comprimento da mão), respetivamente. As distâncias entre o PER e os ramos SR1, SR2 e SR3 foram de 0, 0 e 12 mm, respetivamente. As distâncias medidas entre o eixo do segundo osso metacárpico e os ramos SR1 e SR2 no ponto medio-diafisário foram de 1,9 e -3,3 mm. Não foi possível proceder à análise histomorfométrica. Devido ao reduzido tamanho da amostra, não é possível confirmar a exequibilidade da transferência nervosa no nível proposto, tomando como base as caraterísticas anatómicas e histomorfométricas dos nervos em questão.

O presente artigo de revisão pretende sensibilizar os profissionais de saúde, para que equacionem a Tuberculose (TB) laríngea nos seus diagnósticos diferenciais e, assim, possam prevenir o contágio e morbilidade associados ao frequente atraso diagnóstico e terapêutico. A TB laríngea é uma doença infecciosa, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, muito rara, mas que tem vindo a aumentar de incidência. As suas características epidemiológicas e clínicas modificaram-se muito ao longo do século XX, graças à implementação dos antibacilares. Deste modo, um vasto número de médicos, hoje em dia, não está devidamente familiarizado com a sua nova forma de apresentação e o nível de sensibilidade para com esta entidade é reduzido. Os fatores de risco para esta doença são semelhantes aos da TB pulmonar. A clínica atual assenta, sobretudo, em alterações locais: disfonia com várias semanas de evolução e lesões laríngeas inespecíficas e variáveis na laringoscopia. O diagnóstico é, muitas vezes, difícil e requer um elevado grau de suspeição. O erro diagnóstico mais comum deve-se à semelhança clínica e endoscópica entre a TB laríngea e o carcinoma da laringe. Alguns exames complementares de diagnóstico, caso positivos, são uma boa ferramenta para direcionar o diagnóstico, nomeadamente testes imunológicos, radiografia simples de tórax e análises laboratoriais à expetoração. Um resultado negativo destes exames não exclui o diagnóstico. O diagnóstico é confirmado através da avaliação histopatológica das lesões laríngeas, sendo fundamental a biópsia das mesmas por via laringoscópica. O relatório anatomopatológico permite, ainda, excluir etiologia maligna. O tratamento é idêntico ao da TB pulmonar com habitual remissão completa do quadro, após terapêutica com antibacilares. Mais estudos e com maiores amostras devem ser feitos, de modo a caracterizar, mais fidedignamente, o padrão clínico desta entidade.

The disordered output from the basal ganglia to the pontine tegmentum nuclei is considered responsible for a number of abnormalities in brainstem reflexes in patients with Parkinson's disease. One of the most conspicuous of these abnormalities is the reduced inhibition of the blink reflex by a prepulse stimulus. The circuit of prepulse inhibition involves structures and fibre groups that can be reached by stimuli applied through the electrodes implanted in the subthalamic nucleus for deep brain stimulation (STNDBS). In seven Parkinson's disease patients we examined whether single STNDBS induced prepulse effects on the blink reflex and how they compared with the effects induced by single auditory and somatosensory stimuli. Prepulse inhibition was determined by measuring the percentage inhibition induced in the R2 component of the orbicularis oculi response to supraorbital nerve stimuli. The inter-stimuli intervals (ISI) between the prepulse and the supraorbital nerve stimuli were 0 to 30 ms and 100 ms for single STNDBS and 100 ms for auditory and somatosensory modalities. The results obtained with acoustic and somatosensory stimuli were compared with those obtained from a group of 20 age-matched healthy subjects. Single STNDBS induced significant inhibition of the R2 in all patients at ISIs between 10 and 30 ms, with a mean percentage inhibition of 94% at the ISI of 30 ms. On the contrary, significant inhibition by auditory or somatosensory stimuli was induced in only two out of the seven patients. The mean percentage inhibition at the ISI of 100 ms was 37% for auditory and 40% for somatosensory stimuli, well below reference limits for prepulse inhibition in control subjects (61%). Single STNDBS induces significant prepulse inhibition of the blink reflex in Parkinson's disease patients who have abnormally reduced auditory and somatosensory prepulse effects. This finding helps define the prepulse circuit in humans and the eventual site of its dysfunction in Parkinson's disease.

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Adenosine and gamma-aminobutyric acid (GABA) are both major inhibitory neuromodulators/neurotransmitters in the CNS. We now investigated if endogenous GABA modulates adenosine A(1)-mediated action on synaptic transmission in the hippocampus. Field excitatory postsynaptic potentials (fEPSP) were recorded from the CA(1) area of rat hippocampal slices. The adenosine analogue 2-chloroadenosine (0.15-1 microM) inhibited synaptic transmission with an EC(50) of 398 nM. Blocking GABA(A) receptors with the specific antagonists, bicuculline (10 microM) or picrotoxin (10 microM) potentiated the inhibitory effect of 2-chloroadenosine. The concentration-response curve for 2-chloroadenosine was displaced to the left by a factor of 2 (EC(50)=210 nM) in the presence of bicuculline (10 microM). GABA(A) receptor blockade also potentiated the action of N(6)-cyclopentyladenosine (CPA, 10 nM), a specific adenosine A(1) receptor agonist. Prevention of adenosine accumulation with adenosine deaminase (1 U/ml) did not influence bicuculline-induced potentiation of the effect of 2-chloroadenosine. The potentiation of adenosine A(1)-mediated response by bicuculline was abolished when nitric oxide (NO) synthase was inhibited with nitroarginine (100 microM), and when guanylyl cyclase was inhibited with 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ, 20 microM). The NO donors, (+/-)-S-nitroso-N-acetylpencillamine (SNAP, 300 microM) and diethylamine NONate diethylammonium salt (DEA/NO, 100 microM), significantly enhanced the inhibitory action of 2-chloroadenosine (150 nM). It is concluded that the blockade of GABA(A) receptors induces a potentiation of adenosine A(1) receptor-mediated inhibitory action, an effect that involves NO acting through guanylyl cyclase. Therefore, endogenous GABA might exert an inhibitory effect over adenosine A(1)-mediated responses in the hippocampus, which may represent a physiologic regulatory mechanism between the two inhibitory mediators.

Objective: To assess trends of food intake in Portugal. Design: Analysis of three cross-sectional studies: 1987, 1995-1996 and 1998-1999. Setting: Representative samples of free-living individuals. Subjects: 64 734 men and 71 282 women. Interventions: Food intake was assessed by questionnaires inquiring the number of meals and which foodstuffs (fish, meat, milk, rice/pasta/potatoes, soup, vegetables and fruit) had been consumed the day before. Results: Age-adjusted average number of meals decreased from 3.3+/-0.1 in 1987 to 2.9+/-0.1 in 1998-1999 in both genders (P<0.001). In men, the percentage of subjects consuming meat, milk and potatoes/rice/pasta increased from 73, 66 and 91% in 1987 to 83, 74 and 95% in 1998-1999, respectively. The percentage of subjects consuming soup and fish decreased from 70 and 56% in 1987 to 62 and 53% in 1998-1999, respectively. In women, the percentage of subjects consuming meat, milk, potatoes/rice/pasta and vegetable increased from 70, 66, 89 and 71% in 1987 to 78, 77, 93 and 83% in 1998-1999, respectively. The percentage of subjects consuming soup and fish decreased from 70 and 55% in 1987 to 64 and 53% in 1998-1999, respectively. These trends were more pronounced in the younger age, which also displayed a higher frequency of snacking. Multivariate analysis adjusting for age group, region and educational level showed that the consumption of meat, milk and vegetables increased and the consumption of soup, fish and fruit decreased in 1998-1999 relative to 1995-1996. Conclusions: Within a decade, the Portuguese dietary pattern has changed considerably, shifting from a traditional, south European to a more Westernized, protein-rich diet.

Grapevine is one of the most important fruit crops worldwide. In 2019, over 7.4 million hectares of the world cultivated area were dedicated to viticulture, resulting in the production of 77.8 million tonnes of grapes (International Organisation of Vine and Wine, 2020 report). However, the cultivated species Vitis vinifera L., widely used for berry and wine production, is highly susceptible to the pathogenic oomycete Plasmopara viticola (Berk. & M.A. Curtis) Berl. & De Toni, the causal agent of the grapevine downy mildew disease. This disease is one of the most devastating causing up to 75% of grape loss in one season and important economic losses. Nowadays, the method used to control P. viticola relies on multiple applications of chemical fungicides which have a negative impact on the environment as they accumulate in the soil and water. In Europe alone, 68 thousand tonnes of fungicides were used in 2003, but recently the European Union has established a goal to lower the usage of such chemicals in viticulture. Therefore, there is a need to develop new and more sustainable strategies to control downy mildew disease. The use of beneficial microorganisms with biocontrol capabilities, such as the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), has been pointed out as a viable alternative. With this study we intended to investigate the effect of AMF colonization on the expression of P. viticola effectors during infection of grapevine. Grapevine plants (V. vinifera cv Cabernet Sauvignon) were inoculated with the mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis and root AMF colonization rate and plant growth were assessed. The percentage of root colonization was 10% and mycorrhizal grapevine plants showed a significantly higher shoot biomass compared to non-mycorrhizal plants. Four months post-mycorrhizal inoculation, plants were infected with the pathogen P. viticola. Pathogenicity effectors genes belonging to the RxLR group were analysed and their expression was investigated during the first hours of infection using quantitative real time PCR analysis. Results showed that mycorrhizal inoculation altered the expression of several P. viticola effectors, namely PvRxLR28 and PvRxLR67 that presented an expression decrease in mycorrhizal plants at the two time points post-infection tested, and PvRxLR18 and PvAVH52 that presented an expression increase. These results suggest that the pre-inoculation of grapevine with AMF may interfere with pathogen capabilities to infect the plant by pathogenicity effectors expression modulation. These results further support the hypothesis that AMF can be used to promote more sustainable agriculture, particularly viticulture, practices.

As fibras de celulose regenerada, materiais seminaturais que constituem uma alternativa sustentável às fibras de base petroquímica, são produtos com estruturas celulares e propriedades gerais que propiciam uma enorme variabilidade de aplicações a nível funcional e tecnológico. A Caima - Indústria de Celulose, S.A., fundada em 1888, dedica-se à produção de pasta solúvel a partir do cozimento ao sulfito da madeira da espécie folhosa Eucalyptus globulus, seguido de uma sequência de branqueamento totalmente livre de cloro – TCF (Total Chlorine Free). Atualmente, a Caima fornece pasta solúvel maioritariamente para produtores têxteis de viscose localizados na Ásia. Porém, a necessidade de resposta a uma constante evolução socioeconómica, tecnológica e ambiental impõe uma abertura a novos mercados, nomeadamente ao fornecimento de pasta solúvel para produção de Lyocell. A importância deste produto prende-se, por um lado, pelo facto das fibras de Lyocell possuírem excelentes propriedades estéticas, mecânicas e de conforto, dando origem a uma enorme diversificação de aplicações, e, por outro, do processo Lyocell utilizar produtos químicos não tóxicos e envolver níveis de emissões de poluentes e de consumo de água substancialmente reduzidos. Este trabalho pretende avaliar uma pasta solúvel da Caima (CmL) para a produção de fibras Lyocell. Com esse fim, foi desenvolvido um estudo de comparação entre esta pasta e cinco pastas benchmarking, realizado por três vias: caracterização laboratorial, dissolução em sistema aquoso de NMMO (N-óxido de N-metilmorfolina) e análise por microscopia ótica. Verificou-se, através de ensaios de caracterização laboratorial, que a pasta CmL tem um índice de viscosidade limite de 464 mL·g-1, um teor de α-celulose de 92,8%, um conteúdo de 2,2% de pentosanas e um teor de 0,07% de cinzas. Estes resultados são profícuos para o objetivo em questão. Os valores obtidos de brancura (91,3%), de resistência alcalina com NaOH a 10 e a 18% (90,1 e 95,5%) e de teor de matéria solúvel em acetona (0,151%), são igualmente indicativos de uma pasta que cumpre os objetivos, podendo ainda assim ser alvo de otimização. No que se refere aos parâmetros de micro-Kappa (indicativo da extensão de deslenhificação), número de cobre (indicativo do número de grupos carbonilo) e teores de cálcio e cinzas insolúveis em ácido, encontram-se todos fora do que se consideram critérios adequados tendo em conta o estudo comparativo com as pastas benchmarking, devendo por isso ser reduzidos. O comportamento da pasta CmL em sistema aquoso de NMMO foi idêntico ao das restantes pastas em estudo, sendo que, microscopicamente, foi possível observar fibras de celulose não dissolvidas, fibras em processo de dissolução parcial ou incompleta, mas também fibras em dissolução por fragmentação, fibras em início de dissolução por fenómeno de swelling por ballooning e fibras dissolvidas após rebentamento de balões formados no fenómeno de swelling por ballooning. Resumidamente, pode concluir-se que, apesar de haver margem para otimização de algumas caraterísticas desta pasta da Caima, a mesma tem um bom potencial para aplicação à produção de fibras Lyocell.

As invasões biológicas são amplamente reconhecidas como uma das principais causas da perda de biodiversidade. A resposta mais eficiente e económica para o controlo de espécies invasoras é a erradicação enquanto o número de indivíduos é limitado. Deste modo, é possível prevenir possíveis impactos e evitar os custos de repetição do controlo. No entanto, apresenta um desafio duplo: em primeiro lugar, é difícil reduzir uma população até à erradicação e em segundo, devido à deteção ser imperfeita, é difícil saber se esta foi alcançada. Os riscos de assumir erroneamente o sucesso podem ser altos: a população pode recuperar e tornar a tentativa de erradicação inútil ou pode mesmo escapar da área delimitada. A deteção de espécies invasoras em baixas densidades é, portanto, um aspeto importante para o sucesso de um programa de erradicação. A deteção e a gestão de espécies e comunidades em habitats aquáticos podem ser facilitadas por novas técnicas moleculares. O ADN ambiental (eDNA) é baseado na amplificação de fragmentos de ADN provenientes da pele, pelo, muco ou gâmetas libertados por organismos na água, solo ou ar. Este método não invasivo tem sido aplicado em programas de gestão e erradicação de espécies invasoras de vários taxa, nomeadamente, em anfíbios. As invasões biológicas por anfíbios têm sido, principalmente, não intencionais em todo o mundo e ao longo da história humana, mas têm vindo a aumentar nos últimos anos. Atualmente, a nível global, as populações de anfíbios estão a diminuir e as espécies de anfíbios invasores são parcialmente causadoras destes declínios através de competição, hibridização e introdução de novos organismos patogénicos. Xenopus laevis é um anfíbio nativo da região afro-tropical e a sua distribuição abrange biomas temperados e subtropicais. Esta espécie ocupa, principalmente, águas estagnadas ou de corrente fraca numa variedade de corpos de água naturais e artificiais. Xenopus laevis tem sido usado mundialmente em laboratórios para testes de gravidez e como modelo em estudos de fisiologia e biologia do desenvolvimento. Deste modo, foi introduzida em vários países e populações invasoras estabeleceram-se na Ásia, América do Sul, América do Norte e Europa. Esta espécie possui um conjunto notável de características que a tornam uma invasora muito eficaz: longevidade; capacidade de colonizar uma variedade de ambientes aquáticos; migrações terrestres; alta tolerância à água salgada e condições anóxicas; capacidade de sobreviver à seca enterrando-se; sobreviver sem alimento até 12 meses; a sua reprodução permite o rápido aumento das populações locais. Os seus principais impactos são a transmissão de doenças, com petição e predação de espécies nativas. Houve algumas tentativas de erradicação de populações de X. laevis em vários países, mas a maioria não foi bem-sucedida. A erradicação desta espécie em regiões de clima mediterrânico é mais difícil e atualmente apenas uma operação de gestão e controlo está em vigor. Em Portugal, a espécie foi detetada pela primeira vez em março de 2006 na ribeira da Laje e em fevereiro de 2008 na ribeira de Barcarena, em ambos os casos no concelho de Oeiras. Embora grande parte do país seja climaticamente adequado para X. laevis, pensa-se que a sua distribuição foi limitada às duas ribeiras por quase 40 anos, tornando esta população uma candidata ideal para um programa de erradicação. Assim, desde 2010, os cursos de água e outros habitats em risco de invasão, quase exclusivamente no concelho de Oeiras, estão a ser monitorizados e a remoção desta rã está em curso. Após dez anos de ações de controlo, X. laevis está restrita às áreas a montante das bacias da Laje e Barcarena. A redução da distribuição da espécie e a sua baixa abundância em ambas as ribeiras sugerem eficácia das ações de controlo, embora a erradicação total ainda não tenha sido alcançada. Nesta fase do programa de erradicação, a identificação dos últimos locais onde X. laevis ainda existe é essencial para remoção de todos os espécimes e, consequentemente, uma erradicação bem-sucedida. Assim, este projeto surge da necessidade de comprovar o sucesso das intervenções e ações de controlo do programa de erradicação. Os principais objetivos deste estudo foram identificar os últimos locais onde X. laevis ainda está presente e verificar se o ADN ambiental é uma ferramenta viável para avaliar o sucesso do programa de erradicação de X. laevis em Portugal. Este estudo tem também objetivos secundários: comparar o sucesso das intervenções em habitats lóticos e lênticos com base nos resultados do eDNA; verificar a influência do micro-habitat lótico (pegos ou rápidos) na deteção e concentração de eDNA; avaliar como algumas variáveis ambientais e o histórico de invasão de cada local podem afetar a quantidade de eDNA recolhido. Foram amostrados quinze locais, maioritariamente, no concelho de Oeiras e alguns nos concelhos de Sintra e Cascais. Os locais foram escolhidos de acordo com dois critérios: a importância para a avaliação do programa de erradicação de X. laevis em Portugal e o tipo de habitat aquático. Para a análise de ADN ambiental em cada local, foi bombeada água (100 a 1850 mL) através de filtros de 0.45 µm usando uma bomba peristáltica. Foram também realizados controlos negativos ao filtrar 100 mL de água engarrafada. Após a filtragem, foram recolhidas as seguintes variáveis: temperatura, salinidade, pH, profundidade e velocidade da corrente no ponto de amostragem. Cada local foi também amostrado usando pesca elétrica em dois momentos distintos: após a recolha de água e, mais tarde, já informado pelos resultados obtidos com o ADN ambiental, durante a campanha de erradicação de 2020. As análises laboratoriais foram realizadas no CIBIO-InBIO, Campus de Vairão (Porto, Portugal). A extração do ADN dos filtros foi realizada seguindo um protocolo previamente testado. A técnica de PCR quantitativa em Tempo Real (qPCR) foi utilizada para a amplificação do ADN, seguindo um protocolo e primers já testados com sucesso para detetar ADN ambiental de X. laevis. A especificidade dos primers foi validada no contexto português realizando esta análise com ADN de todas as espécies potencialmente simpátricas de anfíbios. Foram também realizados controlos negativos durante a extração do ADN e qPCR. Dos quinze locais amostrados, cinco tiveram resultados positivos para o ADN ambiental de X. laevis: quatro locais lóticos e um local lêntico. O sucesso das ações de erradicação foi confirmado principalmente em habitas lênticos, mas também foram identificados 3 casos de insucesso. Num desses últimos locais uma amostragem posterior com pesca elétrica confirmou a presença de girinos, uma indicação da importância do ADN ambiental para a identificação dos últimos locais onde a espécie está presente. A deteção e a concentração de ADN ambiental de X. laevis não diferiram entre pegos e rápidos, mas variaram com outros fatores históricos (a abundância da espécie no local entre 2014 e 2019). A velocidade da corrente e a salinidade foram as variáveis que melhor explicaram a concentração de ADN ambiental de X. laevis obtido nos locais positivos. Os nossos resultados corroboram os estudos que recomendam a utilização do ADN ambiental como uma amostragem complementar a outros métodos tradicionais, assim como os que indicam a sua particular adequação na deteção de anfíbios invasores. São listados alguns dos locais onde deverão ser intensificadas as futuras ações de controlo. Para o sucesso do programa de controlo e erradicação de X. laevis em Portugal é importante aumentar a colaboração entre os Concelhos que abrangem as bacias das ribeiras da Laje e de Barcarena.

Parkinson’s Disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder. It is typically known for its motor features like bradykinesia and tremors. However, non-motor symptoms are also present in the disease such as constipation, hyposmia and depression. The principal hallmark of PD is the accumulation and aggregation of alpha-synuclein (aSyn) in the brain, triggering dopaminergic neuronal death. 90% of PD cases are of sporadic origin, and the molecular events that trigger the disease are still unknown. Currently, there is no effective therapeutics able to stop or delay the progression of this disease. Therefore, there is an unmet urgent medical need to identify novel therapeutic avenues that can modulate disease progression. The evaluation of how PD risk factors have an impact in the disease may allow for a better understanding of the molecular events underlying disease onset and progression. Notably, type II diabetes mellitus (T2DM) has been considered an important risk factor for PD. In fact, T2DM patients between 25-45 years old present 380% higher risk of developing PD. Insulin-degrading enzyme (IDE), which is typically known for the proteolytic degradation of insulin, is highly dysregulated in T2DM. It is a multifunctional enzyme, also playing heat-shock responses including chaperone and ubiquitin-activating enzyme activities. Recently, IDE was determined to interact with aSyn and suppress its aggregation in vitro in a non-proteolytic manner, and that IDE and aSyn levels are inversely correlated in human β-cells. Provided that the levels of IDE are decreased in T2DM patients’ pancreas, where aSyn is more oligomerized, it is important to understand if an IDE loss of function also occurs in the brain and if it has an impact in PD pathogenesis. Altogether, we hypothesize that IDE potentiation may protect from aSyn pathogenesis. To validate this hypothesis, we used H4 cells transfected with IDE WT or with a proteolytic inactive variant of IDE (E111Q) and evaluated their protective potential against aSyn cytotoxicity, accumulation and insolubility. A ~6-fold expression of IDE variants did not reduce cytotoxicity in both control cells (GFP) or aSyn expressing cells (aSyn+GFP). They also did not modulate aSyn levels, but both IDE variants were capable of reducing aSyn insolubility. For a lower expression level of the IDE variants, IDE WT but not E111Q was able to reduce the small toxicity induced by aSyn. To potentiate aSyn pathogenesis, we challenged cells to methylglyoxal. Both variants were able to decrease MGO-induced toxicity in both control and aSyn-expressing cells. In these conditions, IDE was not able to modulate both aSyn levels and insolubility. Our findings suggest that IDE may act as a chaperone or dead-end chaperone by suppressing amyloid formation, leading to a decrease on aSyn toxicity. Altogether, we conclude that IDE may play an important role in protecting against aSyn toxicity and aggregation in brain cellular models and it may represent a valid target able to modulate PD’s progression.

As Aquaporinas (AQPs) são uma família de 13 proteínas membranares, cuja principal função é promover o transporte passivo de água, através da célula, em resposta a gradientes osmóticos gerados pelo transporte ativo de solutos [1–3]. As AQPs podem ser divididas em dois grupos, de acordo com os materiais transportados: aquelas que transportam exclusivamente água, que é o caso do nosso objeto de estudo APQ - subtipo 1; e aquelas que para além de água podem transportar pequenos solutos, como por exemplo glicerol [4] - denominadas aquagliceroporinas. Estas proteínas, que possuem a capacidade de atravessar a membrana plasmática, apresentam uma estrutura na forma de um homotetrámero. Cada um dos monómeros inclui um vestíbulo extracelular e citoplasmático, que é conectado através de uma região central, anfipática, designada por poro, num arranjo em forma de barril [5]. Em contraste com a maioria dos canais iónicos, nas AQPs a região do poro não reside no eixo de simetria das quatro subunidades; em vez disso, cada um dos quatro monómeros contém o seu próprio poro [6]. Duas regiões do poro são essenciais para a função das AQPs: a região aromática-arginina, ou filtro de seletividade ar/R, e a região asparagina-prolina-alanina (Asn-Pro-Ala), ou motivo NPA [7]. Tanto o filtro de seletividade ar/R como o motivo NPA participam da exclusão de protões, uma vez que as cargas positivas dos seus resíduos ajudam a repelir a entrada destas partículas no poro da AQP. As AQPs são amplamente expressas em todo o reino animal e vegetal, estando localizadas na membrana plasmática e nos compartimentos citoplasmáticos, particularmente em tipos de células envolvidas no transporte de fluidos. Foi já comprovado que as AQPs desempenham papéis cruciais no desenvolvimento biológico de tumores, estando incluídas na sua histologia, proliferação, migração, angiogénese, e edema associado [8]. Esta correlação é devida ao facto de as AQPs serem sobre expressas nestes tecidos, em comparação com tecidos ditos normais. Consequentemente, as AQPs podem funcionar como potenciais alvos diagnósticos e terapêuticos no tratamento do cancro, uma vez que a sua inibição em células endoteliais e tumorais pode limitar o crescimento e a disseminação do tumor [2,4]. Infelizmente, a taxa de sucesso para a identificação de pequenas moléculas moduladoras de AQPs é muito baixa em comparação com outras proteínas membranares, e os poucos moduladores farmacológicos identificados carecem de especificidade ou acabam por revelar uma alta toxicidade [6]. Uma possível explicação para esta baixa “drogabilidade” é o reduzido tamanho do monómero funcional das AQPs e o pequeno diâmetro do seu poro. No entanto, o contínuo crescimento do conhecimento acerca da relação estrutura-função das AQPs, particularmente da geometria, a nível atómico, dos resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos específicos da região dos poros, torna as AQPs um alvo terapêutico promissor para ser futuramente usado em campanhas de descoberta de novos fármacos [5]. Na sua vertente experimental, as campanhas de descoberta de fármacos são reconhecidas por serem muito demoradas, arriscadas, e caras [9]. Felizmente, com os constantes avanços na tecnologia e o aumento da compreensão dos princípios fundamentais das interações proteína-ligando, as etapas iniciais das campanhas de descoberta de fármacos estão agora mais focadas em previsões computacionais, nomeadamente abordagens baseadas no ligando (Ligand-based) e na estrutura (Structure-based). A abordagem baseada no ligando é um método fundamentado no conhecimento e informação, acerca de compostos ativos e inativos, relativamente a um alvo específico [10]. Este método indireto de desenvolvimento de novos fármacos baseia-se na compreensão da ligação de uma determinada molécula a um alvo de interesse. Essa molécula pode então ser usadas para derivar um modelo farmacóforo que determina as características estruturais mínimas indispensáveis que uma outra molécula deve reter para ser capaz de se ligar ao alvo em estudo [11]. O conceito baseado na estrutura é fundamentado na perceção da estrutura tridimensional do alvo biológico, obtida, por exemplo, através de métodos de cristalografia de raios-X [12]. Este método direto de desenvolvimento de fármacos é análogo ao screening de alto rendimento (HTS), onde o conheci mento da estrutura alvo e do ligando é imperativo [13]. Esta abordagem depende de uma filtragem automática de várias moléculas, na procura daquelas que evoquem a resposta biológica desejada. Uma das principais razões pelas quais os fármacos acabam por falhar nos ensaios clínicos é porque o efeito pretendido, no alvo desejado, não é produzido [14]. Desta forma, a identificação apropriada do alvo é uma etapa crucial no desenvolvimento de novos fármacos. Um bom alvo precisa de satisfazer vários critérios: ser eficaz; seguro; atender às necessidades clínicas e comerciais; e, acima de tudo, ser “drogável”. Um alvo “drogável” é acessível ao fármaco em teste e, após a sua ligação ao mesmo, evoca a resposta biológica desejada que é consistente tanto in vitro como in vivo [9]. Posteriormente ao processo de validação do alvo, os ensaios de screening de compostos são desenvolvidos durante a fase de identificação de hits [9]. Um composto pode ser descrito como um hit se mostrar a atividade desejada através de um screening do composto em questão, e se a sua atividade puder ser confirmada após um novo teste. Desta forma, os desafios significativos deste campo incluem a identificação de hits promissores e o desenvolvimento de leads de alta qualidade para um maior desenvolvimento em potenciais candidatos clínicos [10]. Infelizmente, ainda surgem vários desafios nesta área de estudo, incluindo os limites definidos pelas estruturas proteicas disponíveis, o reconhecimento de ligandos de referência para a proteína alvo, a identificação de resultados promissores, e o subsequente desenvolvi mento de compostos de alta qualidade, para melhorias adicionais, em candidatos clínicos. Dito isto, de forma a obter resultados satisfatórios e a superar estas limitações, novas e inovadoras abordagens e métodos computacionais devem ser desenvolvidos. Consequentemente, o trabalho apresentado nesta tese foi focado no desenvolvimento de um novo plano de trabalho computacional assente em vários métodos distintos que combinam abordagens inovadoras, baseadas no ligando e na estrutura, para identificar novos moduladores da AQP1. Na abordagem baseada no ligando, a identificação de novos moduladores da AQP1 foi realizada com base nas características químicas mais importantes descritas a partir de moduladores de AQPs já identificados. Essas mesmas características já foram previamente usadas em campanhas de screening virtual na procura de novos potenciais moduladores terapêuticos, mas com uma eficiência limitada. Para fortalecer a nossa triagem, aplicámos essa mesma abordagem a várias bases de dados, disponíveis comercialmente, para garantir a construção de uma base de dados global de compostos, com a mais ampla diversidade química possível. Juntamente com abordagens de screening virtual, uma combinação com Docking molecular permitiu a identificação de moduladores alternativos para a AQP1. Nesta abordagem, o foco foi na região dos poros da proteína, que é, até ao momento, a região mais importante e caracterizada como “drogável”. No entanto, e como abordagem alternativa, também foi feita a identificação de novas regiões sensíveis a influenciar a função da AQP1. Usando uma abordagem multiconformacional, com base em simulações de Dinâmica Molecular (MD) da AQP1, totalmente incorporada na bicamada fosfolipídica da membrana, tentámos identificar novas regiões-alvo na superfície da proteína. O uso de conformações adicionais de MD da proteína AQP1 é o que distingue o nosso trabalho de estudos previamente descritos nesta área de investigação, e o que nos dá uma vantagem na identificação de novos moduladores. Esta abordagem multi-conformacional foi seguida com o objetivo de encontrar as conformações mais prováveis para uso neste tipo de estudos, superando assim as limitações impostas por um sistema de proteína membranar com diferentes monómeros. Posteriormente, usámos estas regiões em novas campanhas de screening virtual, baseadas na estrutura, semelhantes ao que tem sido descrito anteriormente para a região dos poros. Após uma classificação de eficiência de ligação baseada na energia e caracterização estrutural obtidas a partir do screening baseado na estrutura, foi criada uma pequena lista dos moduladores mais promissores, para a AQP1. Esta lista foi então usada em novos ensaios de afinidade de ligação através de uma abordagem combinada de simulações de Dinâmica Molecular e cálculos MM/PBSA. Esta abordagem permitiu atribuir uma pontuação, e posterior classificação, mais precisas dos compostos mais eficientes que se ligam à AQP1, o que tornou possível a criação de uma pequena lista final de compostos cujo efeito sobre a função desta proteína será avaliado. Para garantir a validade dos resultados obtidos, todas as previsões computacionais realizadas terão, no futuro, a sua contrapartida experimental.