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Activation of A1 adenosine receptors is important for both the neuromodulatory and neuroprotective effects of adenosine. However, short periods of global ischemia decrease A1 adenosine receptor density in the brain and it is not known if a parallel loss of functional efficiency of A1 adenosine receptors occurs. We now tested if hypoxia leads to changes in the density and efficiency of A1 adenosine receptors to inhibit excitatory synaptic transmission in rat hippocampal slices. In control conditions, the adenosine analog 2-chloroadenosine, inhibited field excitatory post-synaptic potentials with an EC50 of 0.23 microM. After hypoxia (95% N2 and 5% CO2, for 60 min) and reoxygenation (30 min), the EC50 increased to 0.73 microM. This EC50 shift was prevented by the presence of the A1 adenosine receptor antagonist 8-phenyltheophyline, but not by the A(2A)R antagonist 7-(2-phenylethyl)-5-amino-2-(2-furyl)-pyrazolo-[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c] pyrimidine, during the hypoxic period. This decreased efficiency of A1 adenosine receptors was not paralleled by a global change of A1 adenosine receptor density or affinity (as evaluated by the binding parameters obtained in nerve terminal membranes). However, the density of biotinylated A1 adenosine receptors at the plasma membrane of nerve terminals was reduced by 30% upon hypoxia/reoxygenation, in a manner prevented by the A1 adenosine receptor antagonist 1,3-dipropyl-8-cyclopentylxanthine and mimicked by prolonged (60 min) supra-maximal activation of A1 adenosine receptors with 2-chloroadenosine (10 microM). These results indicate that hypoxia leads to a rapid (<90 min) homologous desensitization of A1 adenosine receptor-mediated inhibition of synaptic transmission that is likely due to an internalization of A1 adenosine receptors in nerve terminals.

The relationship between oral health and anxiety/depression were assessed in a cross-sectional study conducted in 388 Portuguese students from the Health Sciences (age: 21 +/- 3 years, 75% women). Oral health included prevalence of reported tooth pain/gum bleeding, dentist attendance, and dentifrice and dental floss use. Anxiety and depression were assessed by the Hospital Anxiety and Depression Scale. Subjects with anxiety or depression had a higher frequency of perceived gum bleeding and reported a higher dentist attendance than normal subjects. On multivariate analysis, anxiety was significantly and independently related to perceived toothache (OR = 2.90, 95% CI: 1.25-6.72) and dentist attendance (OR = 2.15, 95% CI: 1.18 - 3.91) whereas depression was associated with perceived gum bleeding (OR = 4.96, 95% CI: 1.68 - 14.59), and no differences were found regarding teeth brushing or dental flossing. The author concludes that anxiety and depression are related to perceived toothache and gum bleeding, but this association cannot be explained by decreased dental care.

Across the globe, heat waves are getting more intense and frequent. Diatoms are a major group of microalgae at the base of the marine food webs and an important source of long chain polyunsaturated fatty acids that are transferred through the food web. The present study investigates the possible impacts of temperature increase on lipid classes and expression of genes encoding enzymes related to lipid metabolism in Phaeodactylum tricornutum. The heat wave exposure caused an increase in the relative amounts of plastidial lipids such as the glycolipids monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG) and sulphoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) in parallel with a decrease in the neutral lipid fraction, which includes triacylglycerols. In agreement, gene expression analyses revealed an up-regulation of a gene encoding one MGDG synthase and down-regulation of a diacylglycerol acyltransferase (DGAT), a key enzyme in triacylglycerol synthesis. Our results show that heat waves not only negatively impact the abundance of unsaturated fatty acids such as eicosapentaenoic acid (20:5n-3, EPA) and hexadecatrienoic acid (16:3n-4) as observed by the decrease in their relative abundance in MGDG and neutral lipids, respectively, but also induce changes in the relative amounts of the diverse membrane lipids as well as the proportion of membrane/storage lipids. The expression study of key genes indicates that some of the aforementioned alterations are regulated at the transcription level whereas others appear to be post-transcriptional. The changes observed in plastidial lipids are related to negative impacts on the photosynthesis.

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Pharmaceutical residues impose a new and emerging threat to aquatic environments and its biota. One of the most commonly prescribed pharmaceuticals is the antidepressant fluoxetine, a selective serotonin re-uptake inhibitor that has been frequently detected, in concentrations up to 40 μg L-1, in aquatic ecosystems. The present study aims to investigate the ecotoxicity of fluoxetine at environmentally relevant concentrations (0.3, 0.6, 20, 40, and 80 μg L-1) on cell energy and lipid metabolism, as well as oxidative stress biomarkers in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Exposure to higher concentrations of fluoxetine negatively affected cell density and photosynthesis through a decrease in the active PSII reaction centers. Stress response mechanisms, like β-carotene (β-car) production and antioxidant enzymes [superoxide dismutase (SOD) and ascorbate peroxidase (APX)] up-regulation were triggered, likely as a positive feedback mechanism toward formation of fluoxetine-induced reactive oxygen species. Lipid peroxidation products increased greatly at the highest fluoxetine concentration whereas no variation in the relative amounts of long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) was observed. However, monogalactosyldiacylglycerol-characteristic fatty acids such as C16:2 and C16:3 increased, suggesting an interaction between light harvesting pigments, lipid environment, and photosynthesis stabilization. Using a canonical multivariate analysis, it was possible to evaluate the efficiency of the application of bio-optical and biochemical techniques as potential fluoxetine exposure biomarkers in P. tricornutum. An overall classification efficiency to the different levels of fluoxetine exposure of 61.1 and 88.9% were obtained for bio-optical and fatty acids profiles, respectively, with different resolution degrees highlighting these parameters as potential efficient biomarkers. Additionally, the negative impact of this pharmaceutical molecule on the primary productivity is also evident alongside with an increase in respiratory oxygen consumption. From the ecological point of view, reduction in diatom biomass due to continued exposure to fluoxetine may severely impact estuarine and coastal trophic webs, by both a reduction in oxygen primary productivity and reduced availability of key fatty acids to the dependent heterotrophic upper levels.

Durante muitos anos pensou-se que os ouriços-do-mar utilizavam os seus órgãos adesivos - os pés ambulacrários, como ventosas para se moverem e agarrarem às rochas. No entanto, agora sabemos que produzem secreções adesivas e “desadesivas”, que lhes permitem colar-se e descolar-se repetidamente do substrato, através de um adesivo forte, mas temporário. Ao contrário das colas sintéticas, este bioadesivo é resistente e eficaz na presença de água, aderindo a diversas superfícies naturais e sintéticas, podendo ter aplicações biomédicas como adesivo cirúrgico ou como promotor da adesão celular em culturas in vitro. Dado o potencial biotecnológico destes adesivos, as frações proteica e glicídica do adesivo dos ouriços-do-mar têm vindo a ser estudadas, com o objetivo de identificar proteínas e glícidos responsáveis pela adesão, coesão e polimerização do adesivo dos ouriços-do-mar. No entanto, esta caracterização, têm-se focado apenas no adesivo produzido por uma espécie de ouriço-do-mar, Paracentrotus lividus. Este estudo tem como objetivo realizar uma análise comparativa utilizando seis espécies de ouriços-do-mar provenientes de Portugal (Continental e Arquipélago da Madeira), Paracentrotus lividus, Arbacia lixula, Sphaerechinus granularis e Diadema antillarum, e da Suécia, Echinus esculentus e Echinus acutus, pertencentes a diferentes taxa (3 Ordens e 4 Famílias), todas elas com habitats contrastantes. Para isso, recorremos a dois anticorpos (anti-Nectina e anti-Mieloperoxidase) e cinco lectinas (GSL II, WGA, STL, LEL e SBA) e aplicámos metodologias complementares (histoquímica e blotting), em cortes histológicos e extratos dos pés ambulacrários, e na secreção adesiva, para investigar a presença de (glico)proteínas previamente descritas como importantes para a adesão de P. lividus nas restantes espécies em estudo. Os resultados obtidos confirmaram a presença da proteína adesiva Nectina nos órgãos adesivos e no adesivo secretado das espécies de ouriços-do-mar analisadas, estando presente na forma dimérica, mas também em múltiplas sequências mais curtas, algumas das quais específicas dos discos adesivos. Em relação à Mioeloperoxidase, apenas se obteve imunorreatividade com o anticorpo comercial na espécie P. lividus, observando-se a presença de uma banda de elevada massa molecular, provavelmente um dímero, específica dos discos adesivos. As cinco lectinas testadas confirmam a presença de glicoproteínas com resíduos de N-acetilglucosamina e N-acetilgalactosamina nas secreções adesivas e na epiderme adesiva dos pés ambulacrários de todas as espécies em estudo, realçando a presença de uma banda de elevada massa molecular, >245 kDa com resíduos de N-acetilglucosamina específica dos discos adesivos e duas glicoproteínas com massas moleculares aparentes em torno de 135 e 72 kDa, contendo resíduos de N-acetilglucosamina e N-acetilgalactosamina, presentes na epiderme adesiva e não adesiva de todas as espécies. Este estudo fornece as primeiras evidências da presença de componentes comuns, como a Nectina e outras glicoproteínas contendo N-acetilglucosamina e N-acetilgalactosamina, nos adesivos secretados de seis espécies de ouriços-do-mar pertencentes a diferentes taxa e habitat. Embora ainda subsistam muitas questões por responder, o presente trabalho contribuiu para uma melhor compreensão das bases moleculares da adesão temporária dos ouriços-do-mar e da superioridade dos adesivos aquáticos, dando mais um passo para o desenvolvimento futuro de adesivos biomiméticos.

A evolução da tecnologia durante as últimas décadas permitiu a realização de uma transformação digital em praticamente todos os processos de negócio. A transformação digital é nada mais do que automatizar esses processos de negócios através do uso da tecnologia, resultando assim num aumento da qualidade do serviço e das entregas de artefatos, bem como numa diminuição dos custos associados. Um caso muito comum na indústria ´e que com um crescimento de uma empresa, a mesma realize desenvolvimentos de aplicações individuais e sem a capacidade de comunicarem entre si. Por vezes, diferentes aplicações repetem lógicas de negócio já existentes em outras aplicações, apenas porque não conseguem reutilizar essa lógica implementada. Mas, o ideal seria a reutilização e a partilha de funcionalidades entre aplicações. De modo a acompanhar a transformação digital, as empresas necessitam de integrar todas as suas áreas de negócio. Precisam portanto, de capacitar a comunicação entre as aplicações existentes, de modo a permitir a partilha de dados e funcionalidades entre aplicações. Uma das soluções mais adequadas para resolver este problema e garantir a integração de sistemas e aplicações é a implementação de um Enterprise Service Bus (ESB). Um Enterprise Service Bus é uma camada de middleware que fornece um sistema de comunicação mútuo entre serviços, baseado em SOA (Service-Oriented Architecture), promovendo assim agilidade e flexibilidade de comunicação entre aplicações através de um protocolo de comunicação de alto nível. Um dos desafios desta solução é diminuir o custo de implementação, que é tipicamente elevado. A melhor forma de diminuir o custo de implementação é automatizando o processo de criação de serviços de integração construídos sobre esta solução. O objetivo do projeto ´e implementar uma aplicação focada na experiência do utilizador, de modo a automatizar a criação de serviços de integração, melhorando assim a produtividade e capacitando utilizadores para a criação deste tipo de artefactos, que de outro modo não seriam capazes.

As atividades humanas são responsáveis pela atual crise de biodiversidade, a que está associada a extinção de espécies a um ritmo cada vez mais acelerado. As alterações do uso do solo estão entre as principais ameaças que têm levado ao severo declínio da biodiversidade que se tem acentuado nas últimas décadas. Os moluscos terrestres são um grupo muito diverso e que desempenha importantes funções nos ecossistemas. No entanto, também são muito sensíveis a alterações ambientais, pelo que têm o maior número de extinções antropogénicas registadas no reino animal e têm servido como modelo de estudo para compreender o impacto das atividades humanas na biodiversidade. Este trabalho teve como principal objetivo compreender os impactos das alterações do uso do solo na comunidade de moluscos terrestres da ilha de São Tomé. Especificamente foi avaliado: (1) como é que a riqueza e abundância de moluscos terrestres é afetada pela alteração do uso do solo; (2) quais as variáveis ambientais locais que melhor explicam a riqueza e abundância, e (3) quais as diferenças na composição e estrutura das comunidades entre os diferentes tipos de uso do solo. Foram amostrados 132 pontos, espalhados por quatro tipos de uso do solo: floresta nativa, floresta secundária, plantações de sombra e zonas não florestadas. No total foram observadas 33 espécies de moluscos terrestres, das quais 20 são endémicas. Ao nível dos pontos de amostragem, a riqueza e abundância foram maiores nos tipos de uso do solo com níveis intermédios de perturbação antropogénica: floresta secundária e plantação de sombra. No entanto, a elevada riqueza da floresta secundária é explicada pela elevada proporção de espécies endémicas, enquanto que nas plantações de sombra dominam as espécies não endémicas. A intensificação do uso do solo levou a uma diminuição da riqueza e abundância das espécies endémicas e a um aumento das espécies não endémicas. As espécies endémicas estão em geral associadas a ambientes florestados, preferindo locais com uso do solo menos intenso, bem como menor temperatura do solo, maior precipitação e mais manta morta. Estas condições aumentam os níveis de humidade, impedem a secação e proporcionam alimento e abrigo mais diversificado. As espécies endémicas também se encontraram associadas à vegetação típica de zonas com degradação intermédia, sugerindo que baixos níveis de perturbação podem favorecer algumas destas espécies. As espécies não endémicas foram raras na floresta nativa, mostrando uma forte associação a zonas não florestais e a vegetação típica de zonas mais degradadas, possivelmente devido a muitas delas serem espécies introduzidas adaptadas a ambientes antropogénicos. A estrutura das comunidades de moluscos terrestres na floresta nativa foi diferente da dos restantes tipos de uso do solo, sendo apenas diferente da das plantações de sombra quando se analisaram as comunidades de espécies endémicas e não endémicas separadamente. Estas diferenças devem-se por um lado à presença de diferentes espécies endémicas nos dois habitats e, por outro a muitas espécies não endémicas estarem restritas às plantações de sombra. Para compreender estas diferenças seria importante que estudos futuros se foquem na ecologia de cada uma das espécies de moluscos terrestres que ocorrem em São Tomé. Estes resultados reforçam a importância das alterações do uso do solo e das espécies introduzidas como fatores de ameaça para a biodiversidade única de São Tomé, apelando à urgência de adotar práticas agroflorestais e de gestão territorial que se coadunem com a sua conservação. Este é o primeiro estudo que avalia de forma sistemática o impacto das atividades humanas num grupo de invertebrados nas ilhas oceânicas do Golfo da Guiné.

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria que coloniza assintomaticamente o trato respiratório superior humano, nomeadamente a nasofaringe e a orofaringe. É considerado um patobionte, uma vez que pode causar uma série de infeções como pneumonia, meningite e bacteriemia, particularmente em crianças, idosos e indivíduos imunocomprometidos. A emergência e disseminação de clones resistentes a vários antibióticos têm elevado a dificuldade de tratamento desta bactéria. Várias vacinas que têm como alvo a sua cápsula (o maior fator de virulência) já foram criadas e introduzidas no plano nacional de vacinação de vários países. No entanto, apenas são específicas contra alguns serotipos. Assim, S. pneumoniae continua a estar associado com altas taxas de morbilidade e mortalidade no mundo. Têm sido testadas várias estratégias para controlar bactérias resistentes a antibióticos usados tipicamente na clínica. Uma dessas estratégias apropria armas antimicrobianas produzidas por bactérias que co-colonizam o mesmo nicho do patogénico de interesse. Estes pequenos péptidos, ou bacteriocinas, têm frequentemente como alvo outras bactérias semelhantes ao produtor e podem ser uma fonte de novos terapêuticos para controlar S. pneumoniae. No trato respiratório superior, várias bactérias comensais do género Streptococcus colonizam os mesmos nichos que S. pneumoniae, nomeadamente Streptococcus oralis and Streptococcus mitis. S. mitis tem sido estudada em mais detalhe nos últimos anos, e vários loci de síntese bacteriocinas foram descritos. Anteriormente a este trabalho, o laboratório identificou sete comensais pertencentes a estas espécies com um grande potencial inibitório contra o pneumococo. Estas estirpes foram sequenciadas, tendo sido encontrados vários loci de produção de bacteriocinas que poderiam mediar esta inibição. Para o presente estudo, focámo-nos num tipo de locus que ainda não foi descrito em detalhe em S. mitis. Além disso, este locus não foi descrito em S. pneumoniae, sendo menos provável que este tenha um mecanismo de imunidade contra estas bacteriocinas. Começámos por analisar a estrutura dos loci e vimos que estes variavam em complexidade. Todos eles eram compostos pelos genes que codificam para o transportador ComAB e pelo menos uma região de bacteriocinas e proteínas de imunidade. Outros continham proteínas de ligação à colina, peptidases C40, um sistema de transdução de sinal de dois componentes e genes que codificam recombinases/integrases. O transportador ComAB é comum a várias espécies de Streptococcus e sabe-se que tem um papel importante na exportação e maturação da feromona ComC, levando à ativação da competência. Para percebermos se estas bacteriocinas seriam expressas durante o período de competência, procurámos promotores descritos previamente, que são induzidos durante a fase inicial e tardia da competência (ComE-box- fase inicial; SigX-box- fase tardia). Encontrámos uma região ComE-box a montante de comAB em todas as estirpes. Além disso, foram encontrados vários SigX-box a montante de genes que codificam bacteriocinas, proteínas de imunidade e outras proteínas hipotéticas. Curiosamente, várias regiões promotoras SigX-box estavam presentes a montante de um único gene ou operão. Este resultado sugere a existência de artefactos de eventos de recombinação sucessivos ou um mecanismo de maximização de transcrição do locus durante a competência. Para continuar este trabalho, concentrámo-nos numa das estirpes de S. mitis cujo locus continha bacteriocinas que estavam ausentes nas outras estirpes, e que estavam precedidas por cinco SigX-boxes. Para analisar o papel destas bacteriocinas na inibição de S. pneumoniae causada por esta estirpe, criámos um mutante em que a região dos genes das bacteriocinas e proteínas de imunidade foi substituídas por um marcador de resistência à canamicina. A inibição da estirpe selvagem e do mutante foi testada contra 47 isolados de S. pneumoniae por dois ensaios. Um deles permite contacto celular entre S. mitis e S. pneumoniae, e outro utiliza a difusão no agar de sobrenadante do crescimento planctónico das duas estirpes. As experiências que permitem contacto celular, ou overlay assays, revelaram que a estirpe mutante levava à formação de halos maiores do que a selvagem. Para perceber o que contribuía para este efeito, testámos a viabilidade celular e a taxa de crescimento das duas estirpes em meio planctónico. A mutante tinha maior número de células viáveis quando numa cultura com densidade ótica igual à da selvagem. Para controlar para as diferenças de viabilidade nas duas culturas, nas seguintes experiências ajustámos a densidade ótica até à qual crescíamos cada estirpe, para que tivessem o mesmo número de células. Na experiência em que testámos os sobrenadantes da estirpe selvagem e mutante contra os isolados de S. pneumoniae, vimos uma pequena redução do fenótipo de inibição da estirpe mutante. No entanto, as diferenças na inibição foram pequenas, e a mutante ainda conseguia inibir os 47 isolados. Para confirmar que estas bacteriocinas são expressas durante a competência, testámos os sobrenadantes das duas estirpes crescidas a dois valores de pH. Um deles é permissivo para o desenvolvimento da competência (pH 7.5), enquanto que o outro não o permite (pH 6.5). Vimos que o perfil inibitório da estirpe selvagem quando crescida a pH 6.5 era semelhante ao perfil da mutante a pH 7.5 ou pH 6.5. Para testar se, apesar destas diferenças de viabilidade e perfil inibitório da mutante, este locus teria outra função biológica, quantificámos a viabilidade celular e quantidade de DNA extracelular (eDNA) no biofilme. Já foi demonstrado que a libertação de DNA por uma subpopulação das células durante o estado de competência pode ser um mecanismo importante que leva à disponibilização de DNA que as estirpes utilizam para recombinar. Em ensaios de crescimento em biofilme de 24 horas descobrimos que tal como em meio planctónico, a selvagem tem uma menor viabilidade celular. No entanto, os seus biofilmes são aproximadamente 30×mais ricos em eDNA. Em conclusão, este estudo reporta um tipo de locus de bacteriocinas presentes em comensais do género Streptococcus que parece ser expresso em condições de competência. Demonstrámos que um mutante de deleção para estas bacteriocinas não altera muito o seu perfil inibitório contra o pneumococo, mas leva a alterações drásticas na sua viabilidade em meio planctónico e em biofilme. No entanto, a quantidade de eDNA da estirpe selvagem na sua matriz de biofilme é muito superior à da mutante. A função biológica deste locus pode estar associada com um mecanismo alternativo de fratricídio durante o período de competência. Neste caso, uma subpopulação seria morta durante este período, libertando o seu DNA que, pode ser adquirido por células vivas para recombinação, mas também poderia ser utilizado como fonte de alimento, ou para a formação de um biofilme mais robusto.

A Web está presente diariamente na vida de cada um de nós, mas nem todos a conseguem usar da mesma forma. Por exemplo, pessoas invisuais necessitam de ferramentas próprias, neste caso um leitor de ecrã, para interagirem com websites e ouvirem o seu conteúdo. No entanto, nem todos os sites estão preparados para funcionar com essas ferramentas e por isso é necessário que os programadores preparem os websites para essas tecnologias. Existem normas de acessibilidade que permitem ao programador saber o que tem de fazer para tornar a sua página mais acessível. No entanto, essas normas são de difícil interpretação e por isso a acessibilidade acaba por ser ignorada. Para facilitar o teste da acessibilidade de um website existem avaliadores automáticos, que permitem verificar se os websites cumprem as normas de acessibilidade. Estes avaliadores permitem, que qualquer ‘developer’, de forma rápida, teste o seu website para verificar o cumprimento das normas de acessibilidade. Um desses avaliadores é o QualWeb, que será a base do trabalho desenvolvido neste projeto. O projeto tem como principal objetivo acrescentar funcionalidades ao QualWeb para permitir uma mais completa avaliação de páginas web. Vão ser desenvolvidas novas funcionalidades e um extensão para o Chrome. Durante o desenvolvimento do projeto foram desenvolvidas várias arquiteturas do Qualweb com o intuito de resolver diversos problemas de desempenho e de estruturação do código. Foram também implementadas várias funcionalidades novas, necessárias para implementação de regras ACT. Estas funcionalidades incluem, por exemplo, o suporte para o ShadowDom e para a Accessibility Tree. A versão final do QualWeb é um avaliador com desempenho ao nível das ferramentas mais usadas no mercado e com um grande número de regras implementadas. Foi também desenvolvida uma extensão Chrome, neste caso uma extensão das Chrome Dev-Tools, que usa o QualWeb para executar avaliações de acessibilidade.

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Durante o desenvolvimento humano, o trato respiratório sofre alterações morfológicas que levam a alterações nas condições fisiológicas e, consequentemente, da microbiota. Além disso, a sua composição pode variar de acordo com fatores ambientais tais como uso de antibióticos, ser fumador, exposição ao fumo do tabaco, vacinação, entre outros. Streptococcus pneumoniae (ou pneumococos) é uma bactéria que coloniza assintomaticamente o trato respiratório superior, preferencialmente a nasofaringe. Por vezes, esta bactéria causa infeções como otite, pneumonia, bacteriemia ou meningite que, coletivamente, estão associadas a uma elevada taxa de morbilidade e mortalidade. Estas infeções ocorrem especialmente em crianças, em idosos e em indivíduos imunocomprometidos. Em adultos, a taxa de colonização por pneumococos é baixa por comparação com o que ocorre em crianças. S. pneumoniae interage com outras bactérias do trato respiratório superior com as quais partilha o seu nicho ecológico. Por exemplo, foi demonstrada uma interação positiva entre pneumococos e Haemophilus influenzae. Por outro lado, parece existir uma interação negativa – de competição - entre S. pneumoniae e Corynebacterium, Dolosigranulum e Staphylococcus aureus. Os estudos de microbiota têm aumentado devido ao aperfeiçoamento das ferramentas de metagenómica. No entanto, a maioria dos estudos metagenómicos do trato respiratório superior têm sido feitos em crianças ou, quando feitos em adultos, têm-se focado na alteração da microbiota em indivíduos doentes. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a microbiota do trato respiratório superior de adultos saudáveis de forma a complementar a compreensão da dinâmica de colonização de S. pneumoniae. Além disso, analisámos a influência de características populacionais na microbiota da nasofaringe e da orofaringe. Para estudar a microbiota da nasofaringe e orofaringe com base na colonização por pneumococos, utilizámos amostras obtidas num estudo anterior, no qual 87 adultos saudáveis foram amostrados durante um período de 6 meses. Estes indivíduos foram previamente identificados como portadores ou não-portadores de pneumococos através de métodos tradicionais de cultura e métodos moleculares (PCR em tempo real). Para o presente estudo selecionámos 12 indivíduos colonizados com S. pneumoniae que emparelhámos com 47 indivíduos não colonizados com esta bactéria. Para cada indivíduo, selecionámos três momentos de amostragem temporalmente distantes. No total caracterizámos 354 amostras (177 da nasofaringe e 177 da orofaringe): sequenciámos a região V4 do 16S rRNA e fizemos a análise metagenómica das sequências obtidas. Identificámos cinco perfis de microbiota na nasofaringe e dois perfis na orofaringe. Estes perfis estavam associados com características sociodemográficas e/ou fatores ambientais específicos (tais como género, hábitos tabágicos, contacto com crianças e estação do ano em que foi feita a colheita da amostra). Em relação à diversidade, observámos que a microbiota da nasofaringe tem uma menor riqueza (menor número de taxa) que a da orofaringe. Além disso, a microbiota da nasofaringe de portadores de pneumococos tende a ter taxa muito dominantes em comparação com a microbiota dos não-portadores. De facto, quando analisámos a microbiota da nasofaringe dos portadores de pneumococos observámos uma dominância do género Streptococcus que não se refletiu na microbiota da nasofaringe dos não portadores. A microbiota da nasofaringe de portadores de S. pneumoniae tem uma abundância elevada de Streptococcus, H. influenzae, Parvimonas micra ou Dialister e Fusobacterium nucleatum. A amplicon sequence variant que deu origem à identificação de Streptococcus apresentava uma abundância mais elevada nos indivíduos previamente identificados como sendo portadores de pneumococos em comparação com os não-portadores. Vários estudos têm mostrado uma interação sinergística entre pneumococos e H. influenzae e entre P. micra e F. nucleatum, o que suporta as nossas observações. Por outro lado, observámos que a microbiota da nasofaringe de não-portadores de pneumococos tinha uma abundância elevada de Neisseria, Staphylococcus aureus e Staph. lugdunensis. Enquanto que as espécies do género Neisseria têm sido maioritariamente descritas como comensais da nasofaringe, as espécies de Staphylococcus que sobressaíram neste grupo são patobiontes. A microbiota da orofaringe de portadores de S. pneumoniae apresentou, para além de Streptococcus, abundâncias elevadas de taxa bacterianos frequentemente associados a uma microbiota saudável, tais como, Lachnospiraceae e Mollicutes. Além disso, apresentou taxa bacterianos associados com periodontite, tais como, Capnocytophaga, Oribacterium e Tannerella. Em relação à microbiota da orofaringe de não-portadores de pneumococos, esta apresentou abundância elevada de Pseudomonas e Leptotrichia que são géneros descritos como sendo parte deste nicho em adultos saudáveis. Além destes, o género Bacillus também era abundante. Por fim, estudámos possíveis diferenças nas comunidades bacterianas do trato respiratório superior com base nos hábitos tabágicos e no contacto regular com crianças. Estas duas características foram descritas, num estudo anterior, como sendo importantes para a aquisição de pneumococos. A microbiota dos fumadores, independentemente de ser da nasofaringe ou da orofaringe, apresentou maior abundância dos géneros Bacillus e Burkholderia que, para além de incluírem diversas espécies consideradas patogéneos humanos, foram descritos como fazendo parte do metagenoma dos cigarros. Para além destes, identificámos diversos taxa bacterianos que estão frequentemente associados a doenças orais como, por exemplo, cáries. O género Streptococcus apenas apresentou maior abundância na microbiota da orofaringe dos fumadores. Isto pode indicar que, no caso de disbiose causada pelo tabaco, S. pneumoniae coloniza preferencialmente a orofaringe. Por outro lado, a microbiota dos não-fumadores apresentou maior abundância de taxa bacterianos relacionados com uma microbiota saudável. No caso da nasofaringe, Corynebacterium, Dolosigranulum pigrum e Streptococcus sanguinis foram os mais abundantes. No caso da orofaringe, Neisseria, Haemophilus, Leptotrichia e Prevotella foram os géneros mais abundantes. A microbiota da nasofaringe de adultos com contacto com crianças apresentou maior abundância de Moraxella catarrhalis, Streptococcus e H. influenzae. Estes são patobiontes conhecidos por colonizar o trato respiratório superior de crianças. A microbiota da orofaringe, independentemente do contacto com crianças, apresentou taxa bacterianos descritos como fazendo parte deste nicho. Entre estes, estão os géneros Fusobacterium, Leptotrichia, Haemophilus, Veillonella, Prevotella e Neisseria. Além disso, a microbiota da orofaringe de adultos com contacto com crianças apresentou maior abundância do género Streptococcus. Em conclusão, o presente trabalho demonstra que, a microbiota da nasofaringe e da orofaringe de adultos saudáveis é diferente com base na presença/ausência de S. pneumoniae. A microbiota da nasofaringe é menos diversa em comparação com a da orofaringe. A presença de pneumococos na nasofaringe leva a uma alteração da microbiota que não é observada na orofaringe. De facto, a presença desta bactéria em particular parece levar a uma dominância do género Streptococcus na nasofaringe. Identificámos ainda diferentes taxa bacterianos presentes na microbiota dos portadores de pneumococos em comparação com a dos não-portadores, que podem ser explicados pelas interações entre S. pneumoniae e outros taxa neste nicho. Ser fumador ou ter contacto com crianças são fatores que alteram a microbiota relativamente aos taxa bacterianos. Os fumadores apresentam uma maior abundância de bactérias patogénicas que fazem parte do metagenoma dos cigarros e estão associadas a doenças orais. Os adultos com crianças têm maior abundância de patobiontes que são, frequentemente, descritas como colonizadores do trato respiratório de crianças.

Nesta investigação apresenta-se a avaliação da infl uência das alterações do uso e ocupação do solo na dinâmica hidrológica da bacia hidrográfi ca do Rio Zêzere, localizada na região centro de Portugal. A metodologia adotada para a obtenção dos índices topográfi co de encharcamento, potencia de escoamento e produção de sedimentos e a sua modifi cação em função da integração do uso e ocupação do solo é explicada. Apresentam-se os resultados obtidos destes índices, evidenciando-se as alterações espaciais em função das alterações de uso e ocupação do solo. Na análise integrou-se dados complementares (condutividade elétrica da água numa barragem) para calcular a variação da produção de sedimentos. Os resultados apresentados demonstram haver infl uência do uso e ocupação do solo na dinâmica fl uvial da bacia hidrográfi ca do Rio Zêzere, nomeadamente na produção de sedimentos.

A tuberculose é uma das 10 principais causas de morte a nível mundial e é causada pela bactéria intracelular Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). De acordo com a Organização Mundial de Saúde, em 2019, aproximadamente 1,5 milhões de pessoas morreram com tuberculose e estima-se que, atualmente, um quarto da população mundial (cerca de 1,9 mil milhões de pessoas) esteja infetada com tuberculose latente. O aparecimento de estirpes multi e extensivamente resistentes é um problema cada vez mais grave e reflete a necessidade urgente de desenvolver novos medicamentos e estratégias que sejam eficazes no tratamento desta doença. Uma característica típica de M. tuberculosis é a sua complexa parede celular, normalmente conhecida como complexo micolil-arabino-galactano-peptidoglicano (mAGP). Tal como o nome indica, o complexo mAGP é principalmente constituído por uma camada de ácidos micólicos de cadeia longa, um polissacárido de arabinogalactano altamente ramificado e uma camada de peptidoglicano (PG). Todos estes componentes contribuem para a resistência natural destas bactérias a muitos antibióticos e para a modulação da resposta imune do hospedeiro. O PG é altamente responsável pela conservação da integridade celular e os seus processos de biossíntese e reciclagem envolvem vários enzimas essenciais para a viabilidade das micobactérias, sendo considerados, portanto, como potenciais alvos terapêuticos. O PG micobacteriano é caracterizado por diversas modificações químicas, tais como a amidação dos resíduos de D-iso-glutamato (D-iGlu) e ácido meso-diaminopimélico (mDAP). Recentemente, foi descoberto que estas reações são catalisadas pelo complexo enzimático MurT/GatD e pelo enzima AsnB, respetivamente. Foi demonstrado que a amidação do D-iGlu tem influência na suscetibilidade a antibióticos, especialmente a antibióticos β lactâmicos, e no cross-linking, enquanto que a amidação do mDAP parece influenciar a modulação da hidrólise do PG. Além disso, a presença destas duas modificações tem sido associada a uma redução da ativação da proteína recetora nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) 1 do hospedeiro, indicando um possível papel da amidação do PG no reconhecimento pelo sistema imune do mesmo. Para compreender o papel da amidação do PG em micobactérias tanto na resistência a antibióticos, como no reconhecimento imune do hospedeiro, o sistema clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) de interferência (CRISPRi) foi utilizado para construir mutantes knockdown dos genes murT, gatD e asnB (mutantes murT- , gatD e asnB- , respetivamente) em Mycobacterium smegmatis mc2 155 (M. smegmatis), um dos modelos mais utilizados no estudo da tuberculose. O CRISPRi baseia-se na expressão indutível de uma proteína endonuclease Cas9 enzimaticamente inativa (dCas9), em conjunto com um pequeno RNA guia (sgRNA), que pode ser desenhado para ter como alvo uma sequência de DNA específica. Recentemente, este sistema foi desenvolvido e otimizado para micobactérias, sendo simples, prático e económico na inibição da expressão quer de genes essenciais, quer de genes não essenciais, sem provocar clivagem, nem efeitos off-target. O CRISPRi utiliza como indutor a anidrotetraciclina (ATc) e pode ser modelado por diferentes fatores, nomeadamente a concentração de ATc, o grau de complementaridade entre o sgRNA e a sequência-alvo, e o uso de um motivo de DNA de 2-5 par de bases, situado a jusante da sequência-alvo, designado de proto-spacer adjacent motif (PAM), com “forças” distintas. Para avaliar os efeitos do silenciamento dos genes gatD, murT e asnB na viabilidade e crescimento micobacteriano, foram realizadas experiências de spotting. Através das mesmas, os genes murT e gatD, que pertencem a um operão com um promotor comum, foram confirmados como genes essenciais em M. smegmatis, ao contrário do gene asnB. O nível de knockdown dos dois primeiros genes pareceu estar diretamente relacionado com a força da PAM associada a cada mutante. Nos mutantes associados a PAMs fracas, a distância desde a região alvo ao início do gene também pareceu influenciar o silenciamento mediado pelo CRISPRi. Contudo, através da realização de curvas de crescimento dos controlos e mutantes gatD- , esta última correlação não foi observada, uma vez que o perfil de crescimento dos mutantes associados a PAMs fracas aparentou ser semelhante entre si. Apesar das diversas vantagens do CRISPRi, na ausência de indutor, o perfil de crescimento dos mutantes gatD pareceu indicar a existência de uma expressão leaky da dCas9Sth1, assim como algum nível de toxicidade causado pela sobrexpressão da mesma no controlo de M. smegmatis contendo um plasmídeo CRISPRi vazio não-digerido, na presença de ATc. Os níveis de knockdown de um mutante gatD foram avaliados através de qRT-PCR e obteve-se uma diminuição na expressão do gatD de 8,8 vezes, comparando com a estirpe wild-type na presença de ATc. Este resultado salienta a capacidade do CRISPRi de alcançar uma inibição considerável da expressão de genes específicos em M. smegmatis e, em conjunto com os resultados de caracterização fenotípica, indica que esta inibição é suficiente para causar defeitos no crescimento. Em contraste com resultados anteriormente publicados, não se observou nenhuma evidência da existência de um efeito polar provocado pelo CRISPRi, fenómeno que é bastante frequente quando se silenciam genes pertencentes a operões. Para investigar o papel da amidação do PG na resistência a antibióticos, foram determinadas as concentrações mínimas inibitórias e bactericidas (MICs e MBCs, respetivamente) de três antibióticos β-lactâmicos de três classes diferentes (amoxicilina, cefotaxima e meropenemo), na presença e na ausência de um inibidor de β-lactamases (clavulanato), e de dois antibióticos anti-tuberculose de primeira-linha (isoniazida e etambutol) para todos controlos e mutantes gatD- . Diversos mutantes gatD mostraram uma suscetibilidade aumentada aos antibióticos β-lactâmicos testados, especialmente na presença de clavulanato. Em particular para a cefotaxima, o silenciamento do gatD pareceu contribuir para um maior efeito bactericida. Estes resultados sugerem que a ausência de amidação nos precursores de PG destes mutantes pode fazer com que estes sejam substratos mais pobres para as penicillin binding proteins (PBPs) que catalisam as reações de cross-linking, levando a que estas reações sejam menos eficientes e a que as PBPs sejam mais suscetíveis à ação deste tipo de antibióticos. Assim, a inibição da amidação do resíduo de D-iGlu do PG através do sistema de CRISPRi e a utilização de antibióticos β-lactâmicos poderia funcionar para produzir um efeito antimicrobiano sinérgico mais eficaz. Com o objetivo de compreender a contribuição desta modificação do PG no reconhecimento pelo sistema imune do hospedeiro, foram realizadas infeções de macrófagos de ratinho RAW 264.7 com um mutante gatD e foi investigada a sobrevivência intracelular bacteriana. Os resultados indicaram um decréscimo no número de unidades formadoras de colónias (CFUs)/mL deste mutante, na presença de ATc, às 1, 4 e 24 h pós-infeção, comparando com a estirpe wild-type na presença de ATc e com o mesmo mutante na ausência de ATc. Sabendo que a amidação do resíduo de D-iGlu está ausente neste mutante, esta redução do fitness intracelular poderá ser explicada por um maior reconhecimento das micobactérias pelo macrófagos, resultando numa maior taxa de fagocitose e, consequentemente, numa menor capacidade de sobrevivência intracelular. Estes resultados sustentam a ideia de que esta modificação do PG pode ser uma estratégia das micobactérias para evitar o seu reconhecimento por parte do sistema imune inato do hospedeiro, contudo deverão ser realizadas experiências adicionais. Os resultados apresentados nesta tese mostram o potencial da amidação do PG como possível alvo terapêutico e constituem um bom ponto de partida para uma posterior investigação desta mesma modificação em M. tuberculosis. Paralelamente à construção dos mutantes em M. smegmatis, também diversos mutantes murT- , gatD e asnB foram construídos em M. tuberculosis H37Ra e todos os sgRNA desenhados foram confirmados como idênticos para M. tuberculosis H37Rv, o que facilitará uma aplicação futura destas experiências nestas estirpes, ou ainda, em estirpes clínicas, incluindo estirpes multi e extensivamente resistentes, em condições de biossegurança de nível 3.

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Apesar dos avanços notáveis no tratamento da insuficiência cardíaca (IC), esta continua a ser uma das principais causas de mortalidade e de morbilidade nas sociedades ocidentais. Os inibidores do co-transportador de sódio e glucose 2 (iSGLT2), uma nova classe terapêutica projetada inicialmente para reduzir a glicémia em doentes com diabetes mellitus do tipo 2 (DM2), emergiram como uma abordagem terapêutica promissora na IC. Os ensaios clínicos de segurança cardiovascular (ECSC) mostraram que os iSGLT2 reduziram consistentemente e de modo significativo os internamentos por IC em doentes com DM2. Estes resultados geraram uma intensa investigação no sentido de elucidar os mecanismos subjacentes a este efeito. No mesmo sentido, os iSGLT2 reduziram a progressão de doença renal nos ensaios clínicos. Recentemente a evidência clínica e a farmacologia dos iSGLT2 sugerem que a proteção cardio-renal conferida por estes fármacos é independente do seu efeito sobre a glicemia. Este percurso de investigação clínica culminou na realização de ensaios clínicos em doente com IC com e sem DM2, tendo sido confirmado o seu efeito terapêutico independente da diabetes. Esta revisão abrangente sumariza a evidência clínica e os dados de segurança que apoiam a utilização dos iSGLT2 na IC e procura esclarecer os efeitos hemodinâmicos, metabólicos e celulares subjacentes à proteção demonstrada pelos iSGLT2 nesta patologia, independentemente da presença de DM2.

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) as doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade e morbilidade no mundo. Em situações patológicas, quando o sistema hemostático é incapaz de manter o seu equilíbrio, ocorre trombose, a formação de coágulos (trombos) na circulação levando a obstrução do fluxo sanguíneo. Estes trombos são parte da patologia que define o acidente vascular cerebral (AVC) isquémico e outras doenças trombóticas. Vários agentes trombolíticos foram desenvolvidos, mas até ao dia de hoje, ativador de plasminogénio tecidual recombinante (rtPA), denominado de alteplase é o único aprovado pelas entidades reguladoras para pacientes com AVC isquémico. O ativador de plasminogénio recombinante é uma enzima que converte o plasminogénio endógeno na protéase plasmina, que então cliva e digere a rede de fibrina eventualmente levando à lise do trombo no processo conhecido como fibrinólise. Apesar da sua grande atividade trombolítica, rtPA apresenta várias limitações. Especificamente no AVC isquémico, a alteplase tem um fraco perfil farmacocinético com uma curta semi-vida, uma janela temporal terapêutica curta, baixa penetração e recanalização de trombos de maior dimensão e ainda apresenta um risco de hemorragia intracraniana sintomática e severa. Desta forma, é de extrema importância encontrar e desenvolver novos fármacos ou sistemas de entrega de fármacos para melhorar as deficiências da atual terapia trombolítica. Alguns progressos têm sido alcançados com rtPAs de nova geração como a desmoteplase e a tenecteplase, mas esta revisão concentra-se no desenvolvimento da nanomedicina no campo do AVC isquémico, denominado como nanotrombólise. Sistemas de entregas de fármacos usando nanomateriais como lipossomas, nanopartículas poliméricas e nanopartículas magnéticas, quer sozinhas quer em combinação com estímulos externos, como ultrassom ou forças magnéticas têm apresentado resultados muito positivos. Apesar de a maioria destes resultados ser em estudos pré-clínicos, a nanotrombólise aparenta ser capaz de produzir avanços verdadeiramente significativos e de trazer uma perspetiva otimista ao futuro do tratamento do AVC isquémico.

Background: Pre-mRNA splicing is an essential step in gene expression that occurs co-transcriptionally in the cell nucleus, involving a large number of RNA binding protein splicing factors, in addition to core spliceosome components. Several of these proteins are required for the recognition of intronic sequence elements, transiently associating with the primary transcript during splicing. Some protein splicing factors, such as the U2 small nuclear RNP auxiliary factor (U2AF), are known to be exported to the cytoplasm, despite being implicated solely in nuclear functions. This observation raises the question of whether U2AF associates with mature mRNA-ribonucleoprotein particles in transit to the cytoplasm, participating in additional cellular functions. Results: Here we report the identification of RNAs immunoprecipitated by a monoclonal antibody specific for the U2AF 65 kDa subunit (U2AF65) and demonstrate its association with spliced mRNAs. For comparison, we analyzed mRNAs associated with the polypyrimidine tract binding protein (PTB), a splicing factor that also binds to intronic pyrimidine-rich sequences but additionally participates in mRNA localization, stability, and translation. Our results show that 10% of cellular mRNAs expressed in HeLa cells associate differentially with U2AF65 and PTB. Among U2AF65-associated mRNAs there is a predominance of transcription factors and cell cycle regulators, whereas PTB-associated transcripts are enriched in mRNA species that encode proteins implicated in intracellular transport, vesicle trafficking, and apoptosis. Conclusion: Our results show that U2AF65 associates with specific subsets of spliced mRNAs, strongly suggesting that it is involved in novel cellular functions in addition to splicing.

In most clinical microbiology laboratories optochin susceptibility is used in the screening and identification of Streptococcus pneumoniae. We report the characterization of 32 optochin-resistant S. pneumoniae strains from 10 laboratories that constituted 3.2% of all isolates recovered in 2005 in 30 laboratories in Portugal. Resistant isolates consisted of bile-soluble optochin-susceptible and optochin-resistant subpopulations with identical antimicrobial susceptibility patterns, capsular types and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) profiles. The most frequent serotypes—1, 19A, 11A, 3, 8, and 15A—were all common serotypes present in infection and colonization isolates in the country. The PFGE profiles of the 32 isolates corresponded to those of previously identified clones and confirmed that the emergence of these strains could not be attributed to clonal expansion. Clinical laboratories must be aware that optochin-resistant pneumococci are presently circulating in the community. Because accurate identification of S. pneumoniae is essential for correct diagnosis and adequate therapy of patients, we recommend that at least the bile solubility test should be routinely performed in cases of suspected pneumococcal etiology, even if the isolates are optochin-resistant.

A cada ano, o ambiente marinho e costeiro é progressivamente mais afetado pelos efeitos nocivos do lixo marinho, representando uma ameaça para o ecossistema marinho e para a sua biodiversidade. O presente estudo analisou, pela primeira vez, a prevalência, abundância e características dos resíduos antropogénicos, com ênfase nos detritos plásticos, em colónias de gaivota-de-patas-amarelas (Larus michahellis) no arquipélago da Madeira. Um total de 228 amostras de egagrópilas, ninhos e excrementos foram recolhidas em colónias mais próximas de zonas urbanas (ilha da Madeira) e em colónias mais isoladas (ilhas Desertas), no qual se verificou a presença de resíduos antropogénicos em 65,8% e 57,0% das amostras analisadas para cada local, respetivamente. Os resultados obtidos evidenciam a presença de detritos plásticos em todos os tipos de amostra para ambos os locais de amostragem, bem como uma maior prevalência e abundância de detritos plásticos detetados na ilha da Madeira. Verificaram-se diferenças significativas entre locais para as características dos detritos plásticos, nomeadamente nas categorias, cores e tamanhos. O estudo evidencia, ainda, diferenças entre os três tipos de amostra. As cores mais predominantes foram o verde e o branco nas egagrópilas da Madeira e o azul e o branco nas Desertas; o branco nos ninhos; o azul e o preto nos excrementos. Cordas e filamentos, muito semelhantes aos materiais de pesca, foram as categorias de plástico mais observadas, o que indica uma pressão desta atividade nos locais de amostragem. Dos 169 detritos de plástico identificados através da técnica de espectroscopia FTIR, obteve-se uma grande variedade de polímeros, dos quais o PE (25,2%), PET (16,6%) e PVC (13,3%) foram os mais frequentes. São necessárias mais investigações futuras sobre a interação dos detritos plásticos com outras espécies de aves marinhas no arquipélago da Madeira em diferentes intervalos temporais, de forma a compreender os potenciais efeitos destes resíduos nos organismos marinhos deste ecossistema insular.