Repositório RCAAP

N-nitrosaminas, também referidas como nitrosaminas, são classificadas como agentes provavelmente ou possivelmente cancerígenos para os seres humanos, pertencem ao grupo dos compostos N-nitroso, que já demonstraram ser carcinogénicos, mutagénicos e teratogénicos em várias espécies de animais, e são considerados parte do cohort of concern pela Conferência Internacional de Harmonização dos Requisitos Técnicos para os Medicamentos para Uso Humano (ICH). O ser humano está diariamente exposto a várias fontes de nitrosaminas, sendo que estas podem ocorrer, por exemplo, em vários alimentos, como peixe e carne curados, e bebidas alcoólicas; na água potável; no ar; em cosméticos; em produtos de borracha, como chupetas e tetinas; e no fumo de tabaco, sendo esta última a maior fonte de exposição exógena a esta classe de contaminantes. Adicionalmente, estes compostos podem ainda ser formados no organismo, maioritariamente no estômago, e é muito provável que a formação endógena seja a maior fonte de exposição humana. Apesar da ampla distribuição destes contaminantes, a sua presença não era esperada em medicamentos até junho de 2018. Nessa altura as autoridades europeias identificaram a presença da nitrosamina N-nitrosodimetilamina (NDMA) na substância ativa valsartan. Subsequentemente outras nitrosaminas foram também identificadas em lotes de medicamentos valsartan e outros medicamentos da família sartan foram também implicados, levando a recolhas de mercado dos lotes afetados em tudo o mundo. Foi desencadeada uma avaliação do impacto da contaminação com nitrosaminas no balanço risco-benefício destes medicamentos, que estimou que o potencial excesso de risco de cancro seria muito baixo nos níveis em que estas impurezas foram encontradas, concluindo, portanto, que o risco associado à paragem do tratamento seria superior. Até ao momento, estas impurezas foram detetadas também em lotes das seguintes substâncias ativas (e/ou produto acabado) não pertencentes à família sartan: pioglitazona, ranitidina, metformina e rifampicina. De uma forma geral, a formação de nitrosaminas resulta da combinação de aminas nitrosáveis e nitrito ou outros agentes nitrosantes, usualmente na presença de ácido. No entanto, estas impurezas podem também ser introduzidas por contaminação resultante de outras fontes, como por exemplo do uso de equipamento com uma limpeza deficiente e/ou de solventes reciclados. Neste contexto, como medida de precaução, em setembro de 2019 foi solicitado aos titulares de autorizações de introdução no mercado de todos os medicamentos contendo substâncias ativas sintetizadas quimicamente, que efetuassem uma revisão aos seus medicamentos no sentido de avaliar o risco de nitrosaminas poderem estar presentes nos seus produtos, testar todos os medicamentos com potencial risco e implementar medidas de mitigação apropriadas. O objetivo deste projeto prende-se com a primeira parte desse pedido, pretendendo propor uma metodologia que permita à empresa Generis Farmacêutica, S.A., identificar as substâncias ativas e respetivos produtos acabados em risco de formação ou contaminação com nitrosaminas. O desenvolvimento dessa metodologia começou com uma revisão de literatura para identificar as possíveis causas para a presença destas impurezas em medicamentos, que foram de seguida organizadas em três grupos através da construção de um diagrama espinha de peixe: substância ativa, excipientes e produto acabado. Os seguintes fatores foram considerados na avaliação da substância ativa e dos excipientes: presença de precursores de nitrosaminas e condições do processo (com foco no pH e temperatura); equipamento utilizado no processo (uso dedicado ou multipropósito e composição dos agentes de limpeza); uso de solventes ou outros materiais recuperados/reciclados e transporte de solventes “frescos”; uso de matérias-primas, materiais de partida e intermediários contaminados; qualidade da água utilizada no processo (presença de nitritos, nitratos e nitrosaminas); material de embalagem; e no caso da substância ativa foi ainda averiguada a possibilidade de existência processos de degradação que levassem à formação de nitrosaminas ou dos seus precursores durante o prazo de validade. No caso do produto acabado foram considerados alguns fatores também considerados para as avaliações dos outros dois grupos, nomeadamente o equipamento e a qualidade da água utilizados no processo; o material de embalagem utilizado para o produto em bulk e na embalagem primária do produto acabado; e foi também averiguada a possibilidade de existência de processos de degradação do medicamento que resultem na formação de nitrosaminas potencialmente durante o seu armazenamento. Além destes, foi ainda considerada a formulação (possíveis interações entre a substância ativa e os excipientes, em conjunto com a possibilidade do uso de matérias contaminadas com nitrosaminas ou com os seus precursores) juntamente com as condições de processo. De seguida foi aplicada a ferramenta de avaliação de risco recomendada pela Agência Europeia do Medicamento (EMA na sigla inglesa), a FMEA. Para tal, foram sugeridos vários níveis de probabilidade de ocorrência destas impurezas na substância ativa, excipientes, ou produto acabado, considerando situações hipotéticas para cada uma das possíveis causas identificadas em cada um desses grupos. Vários níveis foram também sugeridos para pontuar o parâmetro da detetabilidade, tendo em conta a existência de métodos analíticos capazes de detetar estas impurezas caso existisse risco da sua presença. Foi também proposta uma equação para estimar a severidade (impacto) que a presença destas impurezas teria no doente do produto em avaliação, considerando (1) a máxima dose diária do medicamento; (2) a duração do tratamento; (3) a indicação terapêutica que incluía o público ao qual se destina o medicamento e o local de ação (ação local ou sistémica); e (4) o número de pessoas tratadas. Foi atribuída uma importância superior aos três primeiros fatores (30%) pelas seguintes razões: é sabido que o processo de carcinogénese destes compostos envolve a formação de aductos de DNA, havendo já casos documentados do aumento desta com a dose de nitrosamina, e que a capacidade das enzimas que reparam o DNA é limitada; além disso baseado em estudos animais foi apontado que fetos, bebés e crianças podem apresentar um risco superior de alterações mutagénicas decorrentes da exposição a nitrosaminas. A restante percentagem (10%) foi atribuída ao último fator. A multiplicação das pontuações de severidade, probabilidade e detetabilidade permite obter o valor de RPN, que será tanto mais alto quanto maior for o risco associado à causa em estudo, e de forma a possibilitar a classificação do risco os seguintes limites foram assumidos: risco baixo - RPN ≤ 11; risco médio - 12 ≤ RPN ≤ 26; risco alto - RPN ≥ 27. A estratégia para estimar o risco global da presença de nitrosaminas num dado medicamento foi delineada durante a avaliação do primeiro medicamento em estudo e foi depois aplicada a um segundo medicamento. O primeiro medicamento em estudo foi o Losartan Generis 50mg/100 mg, como tal, foi recolhida toda a informação necessária para pontuar a probabilidade de ocorrência de nitrosaminas na substância ativa losartan de potássio, em cada um dos excipientes e no produto acabado para cada uma das possíveis causas apontadas em cada um desses grupos; e para pontuar também os parâmetros de severidade e detetabilidade. Seguidamente, com os valores de probabilidade, severidade e detetabilidade obtidos calculou-se o RPN para cada uma das causas em estudo. De forma a obter a classificação global do risco foram atribuídas diferentes ponderações a cada uma das causas em avaliação de acordo com a sua importância/contribuição estimada para o risco global da presença destas impurezas em cada um dos grupos em estudo. Foi de seguida proposto que a pior classificação obtida entre a substância ativa, os excipientes e o produto acabado fosse assumida como a classificação global do risco da presença de nitrosaminas no medicamento. Com esta estratégia, foi obtido um valor final de RPN para o medicamento Losartan Generis de 8, o que de acordo com os limites referidos acima VI corresponde a um risco baixo. No entanto, importa referir que esse nível de risco foi obtido apenas após o fabricante da substância ativa ter implementado medidas de mitigação que levaram a uma revisão do nível de risco inicialmente elevado. Seguindo o mesmo racional para o segundo medicamento em estudo, a Ranitidina Generis 150mg/300mg, o valor final de RPN obtido foi 33, o que corresponde a um risco elevado. Até ao momento ainda não foi possível rever o nível de risco obtido para este medicamento, dado que ainda não foram identificadas medidas de mitigação apropriadas. Os resultados obtidos para os medicamentos Losartan Generis e Ranitidina Generis estão em concordância com os resultados das respostas regulatórias em ambos os casos. No caso do primeiro medicamento, inicialmente o CEP da substância ativa foi suspenso com base na avaliação do processo de fabrico que identificou potencial para a formação de nitrosaminas. No entanto, este foi restaurado após o produtor da substância ativa ter investigado as possíveis causas para a formação destas impurezas e ter implementado controlos de rotina adicionais. Já no caso da ranitidina, todos os medicamentos que contêm esta substância ativa foram suspensos da União Europeia. Assim sendo, acredita-se que a metodologia proposta possa ser efetivamente aplicada a outros medicamentos.

A via ubiquitina-proteossoma é um dos métodos celulares utilizados para a degradação de proteínas, onde ocorre a formação de uma cadeia de ubiquitina na proteína alvo, sinalizando-a para degradação no proteossoma. Para a formação da cadeia de ubiquitina é necessária a presença do enzima ativador de ubiquitina (E1), do enzima conjugador (E2) e do ubiquitina ligase (E3). O E1 ativa a ubiquitina, que uma vez ativada é transferida para o E2. O E3 vai servir como adaptador entre o E2 e a proteína alvo, permitindo a transferência da ubiquitina. Tirando partido da via ubiquitina-proteossoma, surgiu uma nova classe de compostos, que tem como objetivo a degradação de proteínas - os PROTACs (Proteolysis-Targeting Chimeras). Estes ligam-se simultaneamente à proteína alvo e ao E3 escolhido, permitindo que ocorra a formação de uma cadeia de ubiquitina que irá sinalizar a proteína para degradação no proteossoma. De forma a possibilitar a interação entre a proteína de interesse e o E3, os PROTACs são constituídos por três componentes: um ligando para a proteína alvo, um ligando para um E3 e um linker que une ambos os ligandos. Apesar de haver um elevado número de E3s, os PROTACs desenvolvidos têm como principais alvos o cereblon (CRBN), o von Hippel-Lindau (VHL) ou o cIAP (cellular inhibitor of apoptosis protein). O linker, para além de unir os ligandos, vai influenciar a interação entre as duas proteínas, devendo o seu tamanho e composição ser o adequado para as aproximar e permitir a transferência da ubiquitina. Uma grande variedade de proteínas já foi degradada usando PROTACs, estando a maioria relacionada com o cancro, embora algumas tenham um papel em doenças neurodegenerativas. Atualmente, encontram-se dois PROTACs em ensaios clínicos, um para o tratamento do cancro da próstata e outro da mama. Estes têm como objetivo a indução da degradação do recetor de androgénio e recetor de estrogénio, respetivamente. Uma das vantagens apontadas para o uso de PROTACs em detrimento dos inibidores de proteínas é que os PROTACs só necessitam de se ligar à proteína o tempo suficiente para que ocorra a ubiquitinação, podendo ser usados posteriormente para induzir a ubiquitinação de uma outra proteína. Por sua vez, os inibidores de proteínas, necessitam de se manter ligados à proteína para exercer o seu efeito. Deste modo, a concentração de PROTAC utilizada poderá ser inferior em comparação à do inibidor. O RIPK2 (Receptor-interacting protein Kinase 2) é um enzima que pertence às vias do NOD1 (Nucleotide binding oligomerization domain 1) e NOD2, participando na ativação do NF-κB (nuclear factor-κB). O NF-κB encontra-se associado ao IκB (inhibitor of kappa B) no citoplasma, onde permanece inativo. Para ser ativado, e poder migrar para o núcleo, é necessário que se dissocie do IκB. Nas vias do NOD1 e NOD2, o reconhecimento de peptidoglicanos bacterianos leva ao recrutamento do RIPK2 e à sua consequente polimerização. Posteriormente, o RIPK2 liga-se simultaneamente ao TAK1 (Transforming growth factor β-activated kinase 1) e ao complexo IκB cinase (IKK), através da sua subunidade IKKγ, permitindo a fosforilação da subunidade IKKβ por parte do TAK1. Uma vez fosforilado, o IKK levará à fosforilação do IκB que terá como consequências a sua dissociação do NF-κB e a sua degradação no proteossoma. O NF-κB, uma vez dissociado do IκB, poderá então migrar para o núcleo. A regulação destas vias pode ocorrer por remoção das cadeias de ubiquitina do RIPK2 ou impedimento da interação do RIPK2 com o NOD1, NOD2 ou XIAP. O papel que o RIPK2 tem nas vias do NOD1 e NOD2, faz com que seja considerado um alvo terapêutico no tratamento de patologias associadas a alterações no seu funcionamento, como a doença de Crohn, colite ulcerosa ou cancro da mama. Os complexos metálicos têm tido um papel importante quer no diagnóstico, quer no tratamento de doenças. Estes possuem características, tais como, a apresentação de maior diversidade de estruturas, devido à possibilidade de terem números de coordenação superiores a quatro, e poderem trocar ligandos com as biomoléculas, que os podem tornar atrativos em comparação com as moléculas orgânicas. Após a aprovação da cisplatina como agente anticancerígeno, houve um aumento do interesse no desenvolvimento de complexos metálicos com propriedades terapêuticas, não só de platina, mas também de ruténio, paládio, ouro ou cobre. Os complexos de ruténio têm mostrado ser promissores, tendo os complexos NAMI-A, KP1019 e IT-139 avançado para ensaios clínicos, embora nenhum tenha sido aprovado. Atualmente, encontra-se em ensaios clínicos de fase II o TLD1433, um complexo utilizado para terapia fotodinâmica. Apesar de todos os complexos de ruténio que seguiram para ensaios clínicos serem agentes anticancerígenos, também têm sido desenvolvidos complexos com o intuito de serem aplicados como antibióticos e antiparasitários. Os ligandos do centro metálico vão ter um papel importante na função que este irá adquirir. A utilização de arenos permite a intercalação com DNA. No caso dos complexos com aplicação em terapia fotodinâmica são utilizadas polipiridinas como ligandos. Se o objetivo for inibir enzimas pode ser coordenado ao centro metálico um inibidor do enzima alvo, como é o caso da inibição de cinases ao coordenar estaurosporina com um centro metálico. Neste projeto pretendemos demonstrar como a introdução de um núcleo metálico no linker do PROTAC poderá melhorar as suas propriedades físico-químicas e biológicas, como a permeabilidade, a solubilidade ou a biodistribuição. Para isso, temos como primeiro objetivo o desenvolvimento de um PROTAC orgânico que contem no seu linker uma bipiridina. O segundo objetivo será a obtenção de dois MPROTACs (metal-linked PROTACs), que diferem nos ligandos espectadores (fenantrolina ou batofenantrolina), através da coordenação da bipiridina do PROTAC orgânico com um complexo de ruténio. Tendo como modelo um PROTAC que induz a degradação do RIPK2, pretendemos desenvolver um PROTAC orgânico que leva à degradação da mesma proteína alvo, mas em vez do VHL pretendemos recrutar como E3 o CRBN. Assim, o nosso PROTAC orgânico é constituído pelo ligando do RIPK2 (24), o ligando do CRBN (28) e um linker que foi dividido em três partes: a [2,2’-bipiridina]-4,4’-dicarboxílico (26) e as porções que fazem a ponte entre a bipiridina e os ligandos (25 e 27). A síntese do PROTAC teve início na obtenção do ligando do RIPK2, onde encontramos adversidades no último passo (a desmetilação do 35), que foram resolvidas ao realizar a reação em sistema fechado. A síntese do ligando do CRBN ocorreu em dois passos, tendo sido necessário no segundo um aumento de pressão para que a reação fosse completa. Para a síntese do 25 e do 27 foi necessária a utilização de grupos protetores antes de realizar a tosilação e substituição nucleofílica, respetivamente. Uma vez com os diferentes componentes do PROTAC prontos, chegou o momento de uni-los. Em primeiro lugar, sintetizámos o composto 50, ao unir o ligando do RIPK2 e o 25, sem adversidades. O passo seguinte foi a condensação do 26 com o 27, no entanto, não obtivemos os resultados esperados. Como alternativa, convertemos os ácidos carboxílicos do 26 em cloretos de acilo antes de realizarmos a condensação com o 27 e metanol. Com este método, obtivemos resultados positivos apenas quando se encontrava presente piridina. Ao repetir a condensação, desta vez com 50 em vez de metanol, obtivemos 54 e 55, no entanto não foi possível purificar nenhum deles. Embora não tenhamos conseguido cumprir nenhum dos objetivos a que nos propusemos, fizemos avanços nesse sentido.

O fígado é um órgão fundamental para diversos processos fisiológicos, incluindo a biotransformação de muitos fármacos. O metabolismo mitocondrial depende de processos regulatórios complexos para satisfazer as necessidades energéticas da célula. O papel da disfunção mitocondrial como base fundamental dos efeitos iatrogénicos induzidos por determinados fármacos constitui o âmbito da presente investigação. O complexo piruvato desidrogenase (PDC) é uma das proteínas multiméricas maiores e mais complexas que representa um papel principal no metabolismo energético. Este complexo é responsável pela formação de acetil-CoA, um metabolito de sinalização na interface de vias cruciais. Devido à sua relevância, a regulação do PDC tem sido amplamente estudada. Este complexo é composto por quatro subunidades catalíticas distintas: piruvato desidrogenase (E1/PDH), dihidrolipoamida transacetilase (E2/DLAT), dihidrolipoamida desidrogenase (E3/DLD) e a proteína de ligação a E3 (E3BP). É importante destacar que a E3 para além de fazer parte do PDC também se encontra envolvida noutros quatro complexos mitocondriais: o complexo a-cetoglutarato desidrogenase, a-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, a-cetoadipato desidrogenase e glicina descarboxilase. Portanto, inferimos que qualquer efeito associado a um fármaco que afecte a subunidade E3 e/ou na atividade do PDC pode induzir efeitos pleiotrópicos em células e tecidos. Relativamente à localização do PDC foi considerada durante anos como estritamente mitocondrial. Mas, curiosamente, a sua presença e função no núcleo foram demonstradas, produzindo acetil-CoA, um substrato para a acetilação de histonas. A translocação dinâmica do PDC mitocondrial para o núcleo liga o metabolismo e a epigenética, uma via determinante para a homeostase energética. O ácido valpróico (VPA) é um fármaco antiepilético usado mundialmente que tem sido reconhecido como um potencial indutor de teratogenicidade ou toxicidade hepática leve a severa, na qual os mecanismos subjacentes ainda não são totalmente compreendidos. Este fármaco também tem sido reconhecido como um inibidor da desacetilase de lisina em proteínas (KDACi), que está relacionado com as suas propriedades anticancerígenas. A nível molecular, este fármaco é um ácido gordo de cadeia ramificada que é capaz de desencadear efeitos significativos no metabolismo energético. A demonstração da formação do valproil-Coenzima A (valproil-CoA, VP-CoA), a interação com a via oxidativa de aminoácidos de cadeia ramificada, a potencial interferência com o transporte do piruvato e com a taxa de oxidação do piruvato fornecem evidencias inequívocas de que este fármaco tem efeitos importantes no metabolismo celular. Nas últimas décadas, diversos estudos demostraram uma disfunção mitocondrial potencialmente associada ao VPA com efeitos na oxidação do piruvato, a-cetoglutarato ou cetoácidos de cadeia ramificada in vitro e no metabolismo da glicina in vivo. E ainda, os efeitos inibitórios do VPA na oxidação do piruvato e do a-cetoglutarato em mitocôndrias de fígado de rato foram relacionados à inibição de E3. Com efeito, em presença de certos substratos respiratórios demonstrou-se que o VPA pode comprometer a função mitocondrial, diminuindo o consumo de oxigénio e a síntese de ATP. Este efeito inibidor sobre a fosforilação oxidativa era claro quando a respiração mitocondrial era sustentada por piruvato e glutamato, não sendo observado em presença de succinato. Com base nos dados disponíveis, coloca-se a hipótese de os efeitos moleculares induzidos pelo VPA poderem associar-se a uma interação com a subunidade E3. Assim um dos objetivos específicos do presente trabalho é precisamente investigar se o principal metabolito mitocondrial do VPA pode induzir a inibição da subunidade E3 do PDC que por sua vez, pode ter impacto na formação de acetil-CoA e no fluxo de metabolitos através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). De igual modo postulamos que as alterações induzidas por fármacos no PDC (ou E3) no núcleo possam estar relacionadas com a atividade KDAC e com o estado de acetilação das histonas. Para investigar estas hipóteses foi utilizado tecido hepático, lisados mitocondriais e alíquotas de urina de ratos Wistar expostos ao VPA com o objetivo de elucidar os mecanismos induzidos pelo fármaco na toxicidade hepática. O plano experimental tem como objetivos: i) elucidar os efeitos induzidos pelo VPA nos perfis dos metabolitos, nomeadamente no ciclo do TCA, pelo que pretendemos analisar ácidos orgânicos em amostras de urina; ii) esclarecer se o VPA in vivo pode contribuir para a inibição da subunidade E3 usando mitocôndrias de fígado de rato; iii) esclarecer os mecanismos da atividade inibitória mediada pelo VPA na desacetilação de histonas; iv) analisar frações subcelulares incluindo núcleos de amostras tratadas com VPA, a fim de identificar a presença de PDC, mais especificamente da subunidade E3, bem como proteínas acetiladas e respetiva expressão diferencial; v) contribuir com uma análise integrada (atividade enzimática, análise de metabolitos e níveis de proteína) para elucidar os efeitos associados ao VPA na subunidade E3 e o respetivo impacto sobre os diferentes complexos nos quais esta participa. Para investigar estas hipóteses foram analisados perfis de ácidos orgânicos, por cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS), em alíquotas de urina de ratos Wistar expostos ao VPA. Além disso, também se sintetizou o principal metabolito mitocondrial do fármaco, valproil-CoA, para ser testado in vitro como um potencial inibidor da atividade da E3. Para tal, foram realizados estudos cinéticos por ensaios espectrofotométricos com a enzima purificada. Os resultados obtidos sugerem o comportamento alostérico típico da enzima E3, já previamente reportado em dois diferentes organismos: Acidianus ambivalens e Corynebacterium glutamicum. Os dados obtidos de cinética enzimática demonstraram que VP-CoA inibe claramente a atividade de E3 in vitro, determinada no sentido reverso (taxa de oxidação de NADH). Um efeito inibitório semelhante na atividade da E3 foi confirmado usando lisados mitocondriais de fígado de ratos expostos ao VPA (in vivo) em relação aos respectivos controlo não expostos ao fármaco. Além disso, os níveis urinários de intermediários do ciclo do TCA (nomeadamente o ácido fumárico, málico, cis-aconítico, cítrico e isocítrico) mostraram ser claramente modificados com a administração do fármaco, onde foi observado uma diminuição da excreção nos níveis dos ácidos succínico, a-cetoglutárico e a-cetoadípico associada ao VPA. Foi também demonstrado um aumento da excreção de ácido láctico, nomeadamente na dose mais elevada de VPA. Portanto, podemos afirmar que os mecanismos de inibição da oxidação do piruvato associados a este fármaco são múltiplos e não totalmente esclarecidos. A relevância do VPA, com um espectro crescente de reivindicações farmacológicas, como antiepilético, anticonvulsivo, agente estabilizador do humor ou coadjuvante em esquemas combinatórios anticancerígenos, é indiscutível. No entanto, demonstrou desencadear hepatotoxicidade ou teratogenicidade potencial, onde o seu papel como um KDACi reconhecido não está totalmente elucidado. Como conclusão, estes estudos demonstram que a formação de valproil-CoA tem um papel relevante nos mecanismos de disfunção do metabolismo energético mitocondrial, nomeadamente através da inibição da atividade de E3. O comprometimento dos complexos enzimáticos associados à subunidade E3 e a dependência intrincada dos níveis de NAD+/NADH podem desempenhar um papel central na patogénese da toxicidade hepática induzida por fármacos.

Atualmente a qualidade e a variedade dos alimentos consumidos são de grande importância não só pelo seu valor nutricional mas também, cada vez mais, pela sua contribuição para a saúde dos consumidores, através do contributo de uma diversidade de compostos, designados por compostos bioativos, aos quais tem sido atribuída a capacidade de exercer influência na redução do risco de desenvolver doenças crónicas não transmissíveis, inflamações, doenças cardiovasculares, entre outras. Todas as estratégias que conduzam ao controlo dos fatores de risco que promovem estas doencas cronicas sao muito importantes. A ingestao de alimentos ricos em antioxidantes e outros compostos bioativos pode ser uma destas estratégias. O leite e os lacticínios são considerados excelentes alimentos e vêm sendo reconhecidos como alimentos funcionais dado conterem uma diversidade notável de compostos com importante atividade biológica. No entanto, em comparação com outros alimentos, os lacticínios apresentam algum deficit de propriedades antioxidantes, designadamente de presença de compostos fenólicos. Este trabalho revê as propriedades nutricionais e funcionais do leite e do queijo, produto lácteo de consumo em expansão, e perspetiva como outra estratégia possível o incremento das propriedades antioxidantes deste produto através da utilização de fontes naturais destes compostos. Para este fim propõe-se a utilização de extratos de folha de cardo Cynara cardunculus L. como aditivo natural e fonte de compostos bioativos.

A lesão de isquemia-reperfusão (IR) hepática é uma complicação inevitável durante a cirurgia hepática, causada pela interrupção do fluxo sanguíneo e subsequente inflamação durante a revascularização do fígado. Uma vez que esta condição patológica tem uma alta taxa de mortalidade associada, há um interesse crescente na investigação de métodos e estratégias para prevenir e atenuar a IR hepática. A IR hepática é caracterizada por uma fase de isquemia, em que a falta de oxigénio e a depleção de ATP leva à interrupção da microcirculação e ao dano mitocondrial, e uma fase de reperfusão, distinguida pela ativação do sistema imunológico do fígado que envolve ativação de macrófagos e neutrófilos, produção de citocinas e quimiocinas, stress oxidativo e aumento da expressão de moléculas de adesão no endotélio hepático. Os mecanismos de resolução de inflamação no fígado são conhecidos uma vez que alguns mediadores anti-inflamatórios são capazes de induzir a cicatrização do tecido hepático e a proliferação de hepatócitos. O sistema hepatobiliar é responsável por diversos processos metabólicos, incluindo formação e secreção biliar, desintoxicação e metabolismo do glicerol. Como a bile é predominantemente composta por água, a formação de bile canalicular é um processo de secreção osmótica que resulta da entrada de água em resposta a gradientes osmóticos criados pela secreção activa de solutos. Quando os hepatócitos são estimulados, o transporte de água ocorre significativamente pela via transcelular através da membrana plasmática. Foi demonstrado que várias células do trato hepatobiliar expressam aquaporinas (AQPs), pequenas proteínas transmembranares conhecidas por auxiliar no transporte transmembranar de água, aumentando a permeabilidade à água e também permitindo o transporte de glicerol e outros pequenos solutos. Além disso, como durante a revascularização do fígado a permeabilidade da membrana é afectada por processos de inflamação, as AQPs situadas em várias células do fígado representam importantes reguladores do equilíbrio hemodinâmico durante a IR. Considerando o papel que as AQPs podem desempenhar durante os processos de IR do fígado, o foco deste trabalho consistiu em avaliar o efeito da IR na expressão de AQPs. O ensaio in vitro com células HepG2 expostas a diferentes estímulos de IR permitiu distinguir o efeito da inflamação do estímulo de hipoxia na expressão de AQPs. Mediante estímulo de inflamação com LPS, as células induziram a expressão de AQPs a fim de restabelecer a homeostase e atenuar os processos biológicos instigados pela sobre-expressão de mediadores da inflamação. Opondo-se à resposta inflamatória, mediante estímulo de isquemia, as células submetidas a uma câmara de hipoxia suprimem a expressão de AQPs como um mecanismo de prevenção de influxo de água nas células e manutenção da homeostase da água durante o processo inflamatório inicial e prevenção de edema celular. Além disso, a administração de formulações lipossomais de fármacos demonstrou ser eficaz na atenuação dos processos de inflamação causados pela exposição das células HepG2 a compostos tóxicos e disfunções relacionadas à inflamação nas células do fígado, já que ambos os fármacos testados (prednisolona e ibuprofeno) mostraram efeitos favoráveis na reversão da inflamação induzida por LPS, diminuindo significativamente a expressão de AQP3 e citocinas. O ensaio in vivo do efeito de IR em células de fígado de rato permitiu delinear um perfil de expressão de AQPs ao longo dos diferentes tempos do processo de IR. As células suprimiram significativamente a expressão de AQPs após 2h de reperfusão, a fim de se opor aos mecanismos decorrentes do processo de isquemia e evitar o influxo de água na célula e edema celular nas primeiras horas de reperfusão, então induziram a expressão de AQPs após 6h de reperfusão a fim de restabelecer homeostase da água e, finalmente, após 24h de reperfusão as células aumentaram a expressão de AQPs. Como a expressão de AQPs e TNF-ɑ após 24h de reperfusão se assemelhava à condição de normóxia, este ensaio confirmou que após 24h de reperfusão as células passam por processos de resolução da inflamação e retornam à homeostase. Além disso, o tratamento com o composto natural quercetina foi ineficiente em atenuar os processos de inflamação induzidos por IR, pois os perfis de AQPs assemelham-se às amostras sem tratamento. Apesar disso, a administração intravenosa de quercetina lipossomal (formada por SPC) apresentou maior expressão de AQPs do que a administração intraperitoneal de quercetina lipossomal (formada por EPC). Para uma melhor avaliação do papel das AQPs nos mecanismos de IR do fígado, devem ser realizados ensaios funcionais e, em última análise, devem ser investigadas estratégias para direcionar e regular as AQPs durante a IR do fígado com o objetivo de reduzir a alta taxa de mortalidade associada a essa condição.

The access of adult learners of a second language (L2) to Universal Grammar (UG) has been widely studied in generative L2 acquisition research. Following the Representational Deficit Hypothesis (RDH), certain features not available in the native language (L1) are not accessible in adult L2 acquisition (Hawkins, 2005; Tsimpli & Dimitrakopoulou, 2007, among others). On the contrary, according to the Feature Reassembly Hypothesis (FRH), adults can access UG to acquire configurations that are not present in their L1 nor in the explicit input (e.g. Lardiere, 2008; Slabakova, 2016). This dissertation aims at contributing to this debate through the study of the L2 acquisition of prepositional relative clauses (RCs) in European Portuguese (EP) by Mandarin Chinese (MC) native speakers. EP displays wh-movement in prepositional RCs formed with standard Pied-Piping (PiP) and non-standard P-Chopping (P-Chop). Non-standard resumptive RCs do not involve movement (Alexandre, 2000). In MC, prepositional RCs involve a mandatory resumptive pronoun (RP), without movement. P-Chop is also attested in the L2 acquisition of prepositional RCs and wh-questions (Klein, 1993; Jourdain, 1996; Perpiñán, 2010), being analyzed as a developmental stage (Perpiñán, 2010, 2020) or evidence of a wild grammar (Klein, 1993). In MC, prepositional RCs display a mandatory resumptive pronoun (Pan, 2016a, 2016b, a.o.), not involving movement (Wen, 2020). The main goals of this dissertation are to understand if MC learners of EP L2: 1) transfer resumption from the L1 into the L2; 2) can acquire new functional features or reorganize (reassemble) L1 features to configure wh-movement in the L2, producing and accepting PiP and P-Chop RCs; 3) show a developmental path in the acquisition of prepositional RCs. To achieve these goals, an oral production task and two self-paced reading acceptability judgement tasks (SPR-AJTs) were used. One SPR-AJT targets relativization strategies and the other focuses on the learner’s implicit knowledge of wh-movement, both contrasting argument and adjunct prepositional RCs. Intermediate (n=36) and advanced (n=36) native MC learners of EP L2, and native EP speakers (N=30) participated in this study. Results show that: 1) learners do not transfer resumption from their L1; 2) both groups of learners produce and accept preferentially PiP RCs; 3) intermediate learners have larger percentages of production of P-Chop with adjuncts than advanced learners; 4) in island configurations, argument RCs are rated worse than adjunct RCs; and 5) RPs do not rescue islands for any group. Overall, these results support the FRH, indicating that L2ers are able to acquire the features that trigger wh-movement, producing PiP and P-Chop. The results also corroborate that P-Chop exists as a developmental stage (Perpiñán, 2010, 2020), with distinct properties from P-Chop in native EP, arguing against previous research that treats P-Chop as evidence of a wild grammar (e.g., Klein, 1993). Finally, the results with syntactic islands challenge the idea that RPs improve these structures in both native and non-native grammars. The convergence between EP natives and Chinese speakers rejecting argument RCs more assertively than adjunct RC also indicates that adult Chinese learners are sensitive to the same grammatical constraints and processing principles of native speakers, and that L2 learners are able to reassemble the wh-features accordingly.

Os perturbadores endócrinos são substâncias exógenas químicas que alteram o funcionamento do sistema endócrino e podem causar efeitos adversos na saúde de um organismo, na descendência, ou na população. Existem vários regulamentos da UE que avaliam o risco de exposição a estas substâncias químicas perigosas, com o objetivo de garantir a proteção da saúde humana e ambiente. Alguns regulamentos da UE têm medidas especificas para substâncias perturbadoras endócrinas como o regulamento do REACH, regulamento dos produtos biocidas e regulamento dos produtos fitoterapêuticos. Outros regulamentos, como o regulamento dos produtos cosméticos, não têm medidas especificas para a avaliação de substâncias perturbadoras endócrinas. Nos regulamentos da UE é possível observar diferenças na definição de critérios para identificação de perturbadores endócrinos e na avaliação destas substâncias. Existe uma dificuldade em decidir se esta avaliação deve ser feita usando uma abordagem com base no perigo ou uma abordagem com base no risco. A dificuldade na avaliação de substâncias perturbadoras coloca-se quando não é possível definir se existe um limiar de segurança ou determinar o nível de exposição em determinados grupos etários. Para os produtos cosméticos o desafio é ainda maior devido à proibição de testes em animais, salvo exceções contempladas pelo REACH, e também à não existência de métodos suficientes de testes validados pela OCDE que consigam avaliar os vários caminhos críticos metabólicos. Desta forma coloca-se a questão de qual deverá ser a regulamentação a aplicar a perturbadores endócrinos nos cosméticos. Com o objetivo de simplificar e consolidar a definição de critérios para a identificação de perturbadores endócrinos é essencial seguir uma abordagem horizontal em toda a regulamentação da UE. Para isto, é importante como primeiro passo, a criação de uma nova classe de perigo, classe “substâncias perturbadoras endócrinas” no regulamento CLP. Este passo vai permitir que existam alterações de simplificação nos restantes regulamentos da UE de forma a que todos contribuam para a manutenção da segurança química na Europa. Assim, o regulamento dos produtos cosméticos terá que contemplar alterações, através da criação de um artigo especifico que indique que substâncias perturbadoras identificadas na parte 3 do Anexo VI do regulamento do CLP sejam proibidas de serem utilizadas em produtos cosméticos. A exceção estará relacionada com uma avaliação pelo CCSC que irá, caso a caso, avaliar o risco de exposição e a identificação da existência de um limiar de segurança. Esta avaliação irá permitir que as substâncias sejam incluídas nas listas negativas ou positivas do regulamento dos cosméticos. Em suma, existem pontos de melhoria no trabalho da CE para a simplificação, consolidação e harmonização de critérios de identificação de substâncias perturbadoras endócrinas, nas abordagens de avaliação, e no desenvolvimento e validação de métodos de testes alternativos. Adicionalmente, é crucial continuar a desenvolver métodos de testes alternativos validados que permitam identificar e avaliar todos os caminhos metabólicos e endpoints, principalmente no regulamento dos produtos cosméticos onde existe a proibição de testes em animais. Estes pontos de melhoria vão facilitar o desenvolvimento de novos produtos cosméticos e simplificar a avaliação pelos reguladores.

A doença inflamatória do intestino integra um conjunto de doenças idiopáticas que envolvem a inflamação crónica do trato gastrointestinal, nomeadamente a colite ulcerosa (UC), a doença de Crohn (CD) e a colite de origem indeterminada (IC). A DII é motivo de preocupação crescente na sociedade atual, verificando-se nos últimos anos um aumento exponencial da sua incidência, quer nos países em desenvolvimento quer nos países desenvolvidos. A abordagem terapêutica usual para a DII engloba a terapia farmacológica, onde se incluem os aminossalicilatos, corticosteroides, antibióticos e imunomoduladores, bem como agentes anti-TNF-α, sendo constante o esforço para desenvolvimento de novos fármacos mais eficazes no tratamento deste conjunto de patologias, reforçando-se a necessidade de uma mudança no paradigma da terapêutica farmacológica e a utilização de novas abordagens terapêuticas tais como o recurso a transplante fecal, a administração de probióticos e/ou de prebióticos, e de plantas medicinais e suas preparações no tratamento destas patologias. O presente trabalho tem por objetivo contribuir para o conhecimento da utilidade concreta das plantas medicinais, na prevenção, remissão ou como coadjuvante da remissão da DII, através da realização de uma revisão sistemática da literatura científica disponível nos últimos 25 anos, usando a metodologia PRISMA. De um número inicial de 398 artigos científicos, obtidos por pesquisa bibliográfica nas bases de dados PubMed, Scopus e Cochrane Library, foram selecionados 14 estudos científicos e nestes identificadas 12 plantas medicinais: Aloe vera, polpa da folha, Andrographis paniculata, folha, Artemisia absinthium, folha e caule, Boswellia serrata, caule, Holarrhena pubescens, casca e semente, Linum usitatissimum, semente, Plantago ovata, semente, Punica granatum, casca, Tripterygium wilfordii, raiz, Triticum aestivum, rebento, Urtica dioica, folha e Zingiber officinalis, raiz. Entre estas plantas, 3 são já objeto de monografia quanto à sua segurança e eficácia, por parte da Agência Europeia de Medicamentos (EMA). Os estudos selecionados são promissores da utilidade destas plantas medicinais na Indução e na manutenção da Remissão da DII. No entanto serão necessários mais estudos clínicos, com recurso a métodos padronizados.

No final do ano de 2019, foi descoberto um novo vírus altamente contagioso ao qual se deu o nome de SARS-CoV-2, (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) o qual provoca a doença COVID-19. Mundialmente, a disseminação contínua de COVID-19 tornou-se um enorme problema de saúde pública com consequências sociais, económicas e políticas devastadoras. Devido ao seu recente surgimento, existe uma grande carência de informação sobre o seu comportamento e da resposta imune do hospedeiro. Esta tese tem como objetivo caracterizar a resposta(s) imune(s) desencadeada pelo SARS-CoV-2 numa coorte de doentes internados nos cuidados intensivos (CI) com COVID-19. Além disso, também pretendemos encontrar padrões associados à qualidade e amplitude das respostas imunes nestes doentes. Os participantes do estudo foram recrutados no Hospital Curry Cabral, em Lisboa, de 14 de março a 14 de junho de 2020. Todos os participantes elegíveis tinham uma infeção provocada por SARS-CoV-2, confirmada por RT-PCR, e caracterizada por uma evolução clínica grave, o que resultou na sua admissão na unidade de cuidados intensivos (UCI) do hospital. De forma a acompanhar a progressão da doença ao longo do tempo de internamento, foram colhidas amostras de sangue aproximadamente a cada 3 dias em cada doente. Além disso, de acordo com os níveis de CRP monitorizados no momento de admissão nos cuidados intensivos, os doentes foram estratificados de acordo com o estado clínico em doentes graves (CRP<200µg/mL) ou doentes críticos (CRP>200µg/mL). Inicialmente, analisámos a resposta humoral mediada por anticorpos entre os dois grupos de doentes. Ao analisarmos os títulos de IgG e IgM específicos para a proteína spike S1, S2 e para a nucleocapside, não observamos diferenças significativas entre os 2 grupos, durante o tempo de permanecia nos CI. No entanto, foi possível observar que os títulos de anticorpos IgM e IgG específicos para a spike S1 eram mais elevados quando comparados com os títulos para a nucleocapside. O que sugere que a proteína spike é mais imunogénica do que a nucleocapside, e que os anticorpos contra esta proteína têm um papel importante na eliminação viral e na recuperação dos doentes. Curiosamente, não detetamos níveis de anticorpos IgG e IgM específicos para a subunidade S2, mostrando a baixa imunogenicidade desta subunidade da proteína spike. Na admissão aos cuidados intensivos, os níveis de anticorpos IgG anti-spike S1 e anti-nucleocapsíde estavam 4 e 2 vezes aumentados, respetivamente, em relação ao background do ensaio de ELISA. No entanto, os títulos de anticorpos IgG continuaram a aumentar até aproximadamente ao 6º dia após a admissão, onde atingiram o plateau. Relativamente aos níveis de anticorpos IgM, estes permaneceram constantes durante o tempo de internamento no UCI. Os níveis de IgM específicos para a Spike S1 estavam 2 vezes aumentados relativamente ao cutpoint, enquanto os níveis de IgM específicos para a nucleocapsíde estavam próximos do cutpoint. Relativamente, aos níveis de anticorpos IgA específicos para a S1 e para a N, observámos uma grande variação entre os dois grupos CRP-estratificados. Os títulos de anticorpos IgA aumentaram até atingir um pico por volta do 6º dia após a admissão na UCI, mas rapidamente decresceram até valores próximo do background do ensaio. Em contraste, a variação nas respostas de anticorpos foi extremamente díspar nos doentes críticos. Enquanto alguns doentes apresentavam uma resposta semelhante à observada nos doentes graves, outros não apresentavam qualquer resposta. Em suma, o perfil cinético da resposta dos anticorpos observado neste estudo é consistente com o reportado em estudos anteriores. No entanto, é possível observar variações temporais na cinética das respostas entre os vários estudos. É ainda importante notar que os doentes que sucumbiram ao COVID-19 não desenvolveram elevados títulos de anticorpos contra as várias proteínas SARS-CoV-2 testadas (Spike S1, S2 e Nucleocapsíde). Nos primeiros dias após entrada no UCI foi possível detetar títulos de anticorpos neutralizantes (NAbs), porém esses títulos eram relativamente baixos. Destaca-se um aumento ligeiro nos títulos de NAbs nos doentes graves em relação aos doentes em estado crítico. Em ambos os grupos, os títulos de NAbs atingiram o seu pico aproximadamente ao 6º dia após a admissão na UCI, permanecendo estáveis durante o restante período de internamento. De forma geral, os doentes graves apresentaram uma resposta cinética para os anticorpos neutralizantes idêntica à dos doentes críticos, contudo apresentaram sempre níveis de NAbs ligeiramente superiores. É, no entanto, de notar que os doentes que morreram não desenvolveram títulos de NAbs ou o seu surgimento foi tardio, sugerindo que as respostas de anticorpos contra SARS-CoV-2 desempenham um papel essencial na sobrevivência à COVID-19. Foi ainda possível notar que os níveis de NAbs estão fortemente correlacionados com os níveis de anticorpos IgG, mas não com as restantes classes IgM e IgA. Estudos anteriores demonstraram que os anticorpos neutralizantes direcionados para o domínio de ligação ao recetor (RBD) são imunodominantes durante as infeções por SARS-CoV-2. Com base nessas observações, decidimos estudar a reatividade das amostras de plasma dos doentes COVID-19 contra os epítopos do RBD do SARS-CoV-2. Observámos, pela primeira vez, a existência de dois clusters de peptídeos, cluster 1 e cluster 2, nos quais a reatividade das amostras de plasma de doentes foi superior. Ao comparar a reatividade entre os dois clusters foi possível observar que o cluster 2 apresentava reatividade superior em relação ao cluster 1. Curiosamente, ao analisar a localização dos clusters na estrutura tridimensional da proteína spike do SARS-CoV-2, vemos que o cluster 2 está localizado no local de interação do RBD com o seu recetor, o ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2), em contraste com o cluster 1, que está localizado no local oposto. Estas observações sugerem que os anticorpos direcionados a estes clusters, particularmente ao cluster 2, são mais prováveis de possuírem uma atividade neutralizantes. Ao analisar a resposta entre doentes graves e críticos não foi possível encontrar diferenças significativas na imuno-reatividade dos peptídeos. No entanto, foi possível perceber que em ambos os grupos, alguns doentes exibiam um padrão distinto de reatividade para os diversos epítopos do RBD. Esses resultados sugerem que a progressão da doença não está inteiramente associada aos títulos e ao alvo dos anticorpos, mas também a outros mecanismos da resposta imune, como a resposta inflamatória mediada por citocinas. Foi ainda possível observar um aumento da reatividade ao longo do tempo de internamento em quase todos os doentes, sendo consistente com as melhorias observadas dos doentes. No entanto, mais estudos são necessários para confirmar a capacidade neutralizante dos anticorpos direcionados a esses dois clusters. Por último, mostrámos que a assinatura COVID-19 foi caracterizada por um aumento dos níveis de várias citocinas inflamatórias e quimiocinas, das quais destacamos as seguintes: GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-5, IL- 6, IL-8, e MIP3a. Os doentes que não sobreviveram, revelaram um perfil de citocinas divergente, caracterizado ou por uma resposta exacerbada ou pela falta de resposta. Os resultados apresentados neste trabalho demostram que vários mecanismos da resposta imune do hospedeiro parecem estar implicados na imunopatogénese da COVID-19. Através da análise da resposta de anticorpos, podemos perceber que estes desempenham um papel importante na progressão e no desfecho clínico da COVID-19. Além disso, a análise da assinatura de citocinas pode dar orientações aos profissionais de saúde para modular a resposta imune inflamatória no estágio inicial da doença, evitando assim trajetórias clínicas graves e até a morte.

A presente dissertação teve como principal objetivo explorar a importância do andrografolido, um diterpeno com o esqueleto ent-labdano, como protótipo na descoberta de novos agentes antibacterianos de origem natural, nomeadamente contra bactérias multirresistentes, um problema grave de saúde pública. Assim, neste trabalho foi preparada uma biblioteca de vinte e seis derivados de andrografolido, um dos principais constituintes da espécie Andrographis paniculata (Acanthaceae), por transformações químicas, incluindo a preparação de cinco novos carbamatos, a partir de isocianatos. Algumas outras transformações efetuadas envolveram reações de acetilação e isomerização, formação de acetais nos hidroxilos em C-3 e C-19, bem como a preparação de um novo derivado contendo a função carbamato, usando 1,1'-carbonildiimidazole. Foi também realizada a remoção do grupo hidroxilo C-14 para posterior derivatização. A partir do composto resultante, foram preparados novos carbamatos, usando isocianatos e 1,1'-carbonildiimidazole. A oxidação e acilação do hidroxilo em C-3, bem como a alquilação do hidroxilo em C-19 também foram efetuadas. Os compostos foram caracterizados por espectroscopia de infravermelho (IV), espectrometria de massa e por experiências de Ressonância Magnética Nuclear (NMR) unidimensional (1H NMR e 13C NMR e DEPT) e bidimensional (HSQC, HMBC, NOESY e COSY). Os compostos sintetizados foram avaliados quanto à sua atividade antibacteriana, pelo método da microdiluição em meio líquido, contra um painel de bactérias Gram-positivas, nomeadamente Staphylococcus aureus ATCC 6538, S. aureus resistente à meticilina (MRSA) ATCC 43866, S. aureus intermediário de vancomicina (VISA) ATCC 106766, S. epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecalis ATCC 11420, E. faecalis resistente à vancomicina (VRE) ATCC 51299 e Mycobacterium smegmatis ATCC 607 e as bactérias Gram-negativas Salmonella typhimurium ATCC 13311 e Escherichia coli ATCC 8739. Para avaliar a atividade antibacteriana, procedeu-se à determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de todos os compostos e da concentração mínima bactericida (CMB) dos compostos com maior atividade antibacteriana. O composto que exibiu maior atividade foi o 3,14,19-triacetil andrografolido (1.18), que mostrou uma atividade antibacteriana significativa (valores de CMI de 7 μg/mL em VISA ATCC 106766 e 15 μg/mL em S. aureus ATCC 6538, MRSA ATCC 43866 e VRE ATCC 51299). Outros compostos com atividade antibacteriana relevante foram os derivados 2.1, 2.2 e 2.4, contendo fenil carbamatos em C-14 e C-19 (valores de CMI entre 15-60 μg/mL contra as mesmas estirpes que o composto 1.18). Determinou-se também que a atividade antibacteriana destes quatro derivados é como bacteriostáticos.

O fígado gordo não-alcoólico (FGNA) é uma doença metabólica crónica, caracterizada pela acumulação excessiva de gordura no fígado, muitas vezes resultante de uma dieta rica em gorduras e calorias, e associando-se com a diabetes de tipo 2. Durante os últimos anos, a taxa de incidência do FGNA cresceu de forma significativa, atingindo um quarto da população mundial adulta em 2016, sendo expectável que esta tendência se mantenha. O FGNA é caracterizado pela presença de lesões hepáticas, desde a esteatose simples até à esteatohepatite não alcoólica (EHNA), podendo mesmo progredir para fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Ainda que a patogénese da doença não seja bem conhecida, pensa-se que seja uma doença bastante complexa e multifatorial, influenciada por vários fatores, incluindo fatores genéticos, idade, sexo, e estilo de vida. É de notar que a doença se caracteriza por uma fase precoce assintomática e, por isso, o diagnóstico ocorre numa fase mais tardia. Apesar da reversibilidade da doença, não existem tratamentos pré-estabelecidos na prática clínica. Não obstante, durante os últimos anos, têm sido identificados vários mecanismos que desempenham um papel no desenvolvimento e na progressão do FGNA, sugerindo vários alvos possíveis para o diagnóstico e para a terapêutica. Os microRNAs são pequenos RNAs endógenos não codificantes que atuam como reguladores da tradução de vários genes. Foi já demonstrado que vários microRNAs se encontram desregulados nos doentes em diversos estadios do FGNA, evidenciando o seu papel potencial quer no diagnóstico quer na terapêutica. Vários grupos de investigação, incluindo o nosso, já demonstraram a ocorrência da regulação positiva do microRNA-21 (miR-21) no fígado, nos músculos e no soro de pacientes com FGNA. Os nossos estudos demonstraram que a regulação negativa do miR-21 em ratinhos alimentados com dietas deficientes em metionina e colina provocou uma redução significativa na ocorrência de fibrose hepática, esteatose, e inflamação. De forma semelhante, a deleção do miR-21 hepático resultou na prevenção da intolerância à glucose e da esteatose em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gorduras. Também foi demonstrado que a desregulação de recetores nucleares ativados por ácidos biliares, particularmente do recetor X dos farnesóides (FXR) e do recetor 5 acoplado a proteínas G (TGR5), desempenha um papel importante na patogénese do FGNA. Ratinhos com defiência no FXR alimentados com uma dieta rica em gorduras desenvolveram manifestações patológicas da EHNA, enquanto que ratinhos knockout da SHP-1, um alvo ajusante do FXR, não desenvolveram quaisquer manifestações clínicas de esteatose hepática. Além disso, o nosso grupo demonstrou também que a ativação do recetor FXR através de indução pelo ácido obeticólico em simultâneo com a inibição do miR-21 em ratinhos alimentados com uma dieta “fast-food” preveniu significativamente a progressão da doença, incluindo a restauração do metabolismo lipídico no fígado. Por outro lado, outros autores demonstraram que a ativação do TGR5 resulta num decréscimo da produção de citocinas pró-inflamatórias, na sobreexpressão do GLP-1 e numa melhoria da esteatose hepática e da sensibilidade à insulina. Nesse sentido, o INT-767, um agonista duplo dos recetores FXR e TGR5, tem vindo a ser investigado como um potencial agente terapêutico para o tratamento do FGNA. Em ratinhos alimentados com uma dieta rica em gorduras, o INT-767 foi capaz de melhorar o metabolismo lipídico e da glucose, a sensibilidade à insulina, a aterosclerose e a resposta inflamatória. O objetivo principal deste trabalho foi elucidar se o silenciamento do miR-21, através do uso de um inibidor sintético especifico - antagomiR-21 -, e/ou a ativação dos recetores FXR e TGR5, usando o agonista duplo INT-767, demonstram um efeito curativo no tratamento do FGNA, prevenindo a progressão da doença. Ratinhos C57BI/6J com 3 semanas foram alimentados com uma dieta rica em gorduras e deficiente em colina (HFCD), ou com uma dieta controlo, durante 12 semanas. Após este período, os ratinhos demonstraram evidência de esteatose hepática. Neste ponto, os ratinhos foram injetados com o antagomiR-21 e/ou tiveram a sua dieta suplementada com o INT-767, durante 12 semanas adicionais. Às 24 semanas, os ratinhos foram sacrificados e os tecidos hepático e adiposo, assim como o soro, foram recolhidas e processados para a realização de testes histológicos, bioquímicos e moleculares. A expressão de proteínas e genes envolvidos em várias vias de sinalização do FGNA, assim como de vias ajusante dos recetores nucleares, foi avaliada através de técnicas de Western blot, ELISA, e qRT-PCR. Além disso, a expressão de uma seleção de genes envolvidos no cancro do fígado foi analisada através de técnicas de microarray por qRT-PCR . Os resultados obtidos demonstraram que o tratamento com o antagormiR-21 e o INT-767, de forma isolada ou simultânea, resultou numa melhoria das manifestações clínicas da doença do FGNA, induzidas pela dieta HFCD. Ambos os tratamentos, isolados e combinados, levaram a uma prevenção parcial do ganho de peso, normalização dos niveís séricos de enzimas relacionadas com dano hepático, e prevenção do desenvolvimento de características histopatológicas da doença. O tratamento com antagomiR-21 e/ou o INT-767 diminuiu significativamente a expressão do microRNA endógeno miR-21 no fígado. Em paralelo, observou-se um aumento da atividade dos recetores FXR e TGR5, demonstrado através da análise dos seus alvos ajusante SHP-1 e CYP7a1; e PKAc-α, respetivamente. É de notar que a expressão proteica de ambos os recetores FXR e TGR5 no fígado demonstrou ser positivamente regulada após os tratamentos, possivelmente como resultado da melhoria geral na saúde dos animais. O tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, tanto de forma isolada como em combinação, reverteu vásrias desregulações metabólicas relacionadas com o FGNA, agindo frequentemente em sinergia. A expressão hepática da PPARα, uma proteína que nosso grupo já demonstrou melhorar o FGNA, demonstrou ser regulada negativamente e de forma significativa em ratinhos não tratados, alimentados com uma dieta HFCD, e positivamente em ratinhos na dieta mas tratados com o antagomiR-21 e/ou o INT-767. Curiosamente, apesar de termos previamente demonstrado que a PPARα é um alvo do miR-21, esta proteína sofreu uma regulação positiva mais significativa após o tratamento com o INT-767. Além disso, o tratamento combinado demonstrou ter um efeito sinergístico. O FGF-21, um regulador da homeostase dos glicolipídos, muitas vezes estimulado pela PPARα, mostrou ser regulado positivamente, quer no soro quer no fígado, pelo tratamento com o INT-767, de forma isolada ou em combinação com o antagomiR-21. O tratamento com o antagomiR-21 e/ou INT-767 resultou ainda numa diminuição da desregulação mitocondrial, se bem que com efeitos sinergísticos reduzidos. É de notar que a expressão hepática do NRF2, uma proteína com papel inibidor da esteatose hepática, demonstrou manter-se inalterada em ratinhos alimentados com a dieta HFCD em comparação com os ratinhos na dieta controlo. Ainda assim, a expressão hepática do NRF2 aumentou significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou com o INT-767. A expressão da proteína mitofusina-2, uma proteína essencial à fusão mitocondrial, aumentou significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e o INT-767, quer de forma isolada ou combinada. Em paralelo, a expressão heática da DRP1, uma proteína essencial à fissão mitocondrial, diminuiu significativamente após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT767. Além disso, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 resgatou a regulação positiva da expressão hepática das proteínas apoptóticas caspase-2 e -3, induzida pela dieta HFCD, demonstrando um pequeno efeito sinergístico em ambos os casos. Também a via de sinalização da insulina foi afetada em ratinhos alimentados com a dieta HFCD, que exibiram aumento da fosforilação da proteína JNK, comparando com ratinhos na dieta controlo. Por sua vez, o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767 reduziiu os niveís de ativação do JNK. Os animais alimentados com a dieta HFCD exibiram ainda niveís reduzidos de fosforilação das proteínas IRS1 e Akt, comparando com os animais controlo, enquanto que os tratamentos com o antagomiR-21 e o INT-767, sozinhos ou em combinação, reverteram quase por completo a inativação destas proteínas. A análise da expressão génica de genes selecionados no tecido adiposo visceral correlacionou-se com os resultados previamente obtidos no tecido hepático. Em particular, a expressão da PPARα foi inibida em ratinhos alimentados com a dieta HFCD, comparando com os ratinhos na dieta controlo, mas resgatada após o tratamento com antagomiR-21 e/ou INT767. De forma semelhante, a expressão da SHP-1 e do TGR5 foi resgatada após o tratamento. A expressão da FABP4, normalmente aumentada em resposta à acumulação de lípidos, foi inibida significativamente por ambos os tratamentos. Finalmente, ratinhos alimentados com a dieta HFCD evidenciaram ainda a activação de vias de sinalização oncogénicas no fígado, cujo padrão de expressão foi aproximado dos ratinhos controlo após o tratamento com o antagomiR-21 e/ou o INT-767. No seu conjunto, os resultados obtidos nesta Tese demonstram que o antagomiR-21 e/ou o INT-767 revertem a desregulação hepática do metabolismo lipidico e da função mitocondrial, reduzindo simultâneamente o ambiente pró-inflamatório e a apoptose. O tecido adiposo visceral sofreu igualmente uma melhoria metabólica em ratinhos alimentados com a dieta HFCD mas tratados com uma ou ambas as estratégias terapêuticas em estudo. Além disso, ambos os tratamentos resultaram na regulação negativa de vários genes associados ao cancro do fígado. Em conclusão, o tratamento isolado com o INT-767 ou o antagomiR-21 previnem a progressão do FGNA. Além disso, o tratamento combinado foi mais eficiente no resgate das desregulações metabólicas e na prevenção da ativação de vias de sinalização oncogénicas, devendo por isso ser considerado como uma estratégia terapêutica putativa para o FGNA e o desenvolvimento de cancro associado ao FGNA.

Kathy Acker (1937-1997) was a celebrated experimental writer, who found a striking degree of commercial and critical success in the mid-1980s. Born and primarily based in the U.S., Acker managed to trace a creative and professional trajectory across the Atlantic, becoming an esteemed author - and often, a minor celebrity - both in the U.S. and in the U.K. Her book-length, novelistic experiments challenged the tenets of the contemporary novel, powerfully subverting encoded expectations and dominant definitions of narrative form, of authorial intent, and of literary creativity. Often grouped with post-modernist contemporaries, Acker's work both expresses something of that historical moment and surprises its convened temporality, producing imaginative pathways across various counter-traditions of innovative and oppositional literature. Variously described as pornographic, feminist, plagiaristic, violent, transformative, queer, punk, bad or derivative, her writing holds a compelling force of its own, and attests to a distinctive ethos of transgression. This project departs from extant understandings of Acker's work and the various ways it has been valued and rememorated across time - especially as the anniversary of both her birth and her death was celebrated in 2017. Recognizing these more recent processes of recollection and rememoration across various media and discursive contexts, this project unequivocally situates itself amidst an ongoing reassessment of the capacities and potentialities of Acker's body of work. However, unlike most contemporary discussions of Acker's writing, this project holds that her standing as a radically committed writer demands increased – rather than decreased – scrutiny into the more normative impulses of her work. While emphasizing the multiple ways her writing disrupted normalized structures of meaning and understanding, we must also probe into those moments where it reiterated, repeated, and reasserted the political fictions of hegemony and dominion. Three categories prove indispensable to this confrontation with the defining limits of Acker’s work: race, gender, and sexuality. With a strong intersectional emphasis, the present project suggests readings of three of Acker's novels: Kathy Goes to Haiti (1978), Blood and Guts in High School (1984) and Empire of the Senseless (1988). Tracing a comparative critical trajectory across the three texts, it evinces the inevitable contradictions of Acker's writing, and attempts to widen the scope of present conversations about the politics and poetics of her work.

O consumo de produtos biológico tem vindo a aumentar ao longo dos anos. Os consumidores optam por estes produtos com o objetivo de adotarem uma alimentação mais saudável, que tenha impactos positivos na sua saúde e no meio ambiente. O trabalho desta dissertação foi desenvolvido em duas fases. Uma primeira em que foi analisada a legislação europeia e a nacional e foram analisados os rótulos de 130 amostras de géneros alimentícios provenientes de produções biológicas. Verificou-se que a legislação não está a ser totalmente cumprida. Numa segunda fase foi disponibilizado um questionário sobre o consumo e rotulagem de produtos biológicos, através da plataforma Google Forms. A análise dos resultados permitiu concluir que os consumidores não estão esclarecidos relativamente a um produto biológico e que não estão devidamente informados de como podem identificar um produto biológico recorrendo à consulta do rótulo.

O objetivo principal da tese é contribuir para a implementação e avaliação de medidas de controlos de contaminação cruzada e de contenção do produto para se iniciar a produção de medicamentos citotóxicos parentéricos na nova instalação (Hikma 4 – Fábrica de Alta Contenção). Este projeto foi desenvolvido dentro de uma equipa multidisciplinar, cujo principal objetivo era implementar o processo de produção de medicamentos citotóxicos liofilizados. A Hikma 4 foi construída com o propósito de produzir produtos potentes, como os medicamentos parentéricos citotóxicos. Estes medicamentos são utilizados para o tratamento do cancro e são conhecidos por terem efeitos genotóxicos, mutagénicos, teratogénicos e carcinogénicos nos operadores que estão em contactos com estes produtos. Por essa razão, a produção de medicamentos citotóxicos requer uma instalação com estratégias de contenção do produto para proteger os operadores envolvidos e o meio envolvente. Para além disso, medicamentos parentéricos requerem um elevado nível de controlo ambiental no processo de produção de forma a minimizar os riscos de contaminação por microrganismos, partículas e pirogénios. A esterilidade é um atributo importante do produto final que deve ser controlado até ao final do processo. O início deste trabalho consiste numa extensa revisão de literatura de todo o processo de produção de medicamentos citotóxicos liofilizados e das tarefas adjacentes a esta produção. A legislação atual foi revista para compreender o processo de fabrico e os controlos definidos pelas diretrizes para proteger o produto, operador e meio envolvente. Atualmente, a legislação relacionada com os medicamentos citotóxicos em ambiente industrial encontra-se vaga e por essa razão este projeto focou-se na transferência de conhecimento e informação para a aplicação real de procedimentos implementados na Hikma 4. O seguinte capítulo corresponde a uma transposição da informação contida nas diretrizes oficiais e na implementação das mesmas no contexto real da Hikma. As estratégias implementadas envolvem procedimentos relacionados com as instalações, com o processo de fabrico propriamente dito e com os operadores que se encontram envolvidos desde o momento em que as matérias-primas necessárias para a produção do lote são transferidas para se iniciar a produção de um novo lote de medicamentos citotóxicos. A fábrica foi desenhada de forma a evitar a contaminação cruzada e proteger a esterilidade do produto final. Os fluxos de pessoas, materiais e componentes estão definidos para que não haja contaminação e para que o produto final seja entregue ao armazém com qualidade. O processo de produção de medicamentos citotóxicos liofilizados tem diversas etapas, entre elas, preparação de lote, enchimento, liofilização e capsulagem, que foram analisadas individualmente. Em cada uma das etapas foram implementadas estratégias de contenção do produto, como é o caso dos isoladores, e procedimentos de proteção do produto e dos operadores, como é o caso do equipamento de proteção individual. A produção de medicamentos citotóxicos será realizada por operadores treinados em todas as etapas de produção, incluindo, uso do equipamento de proteção individual e conhecimento dos procedimentos para contenção do produto e proteção do ambiente. Para além disso, foram definidos procedimentos para a ocorrência de derrames e tratamento de resíduos citotóxicos provenientes do processo de fabrico. Os resíduos citotóxicos sólidos e líquidos podem contaminar o meio ambiente e por essa razão devem ser deviamente tratados antes de estarem em contacto com qualquer tipo de material que não esteja contaminado. O seguinte capítulo deste projeto envolve a apresentação de uma avaliação de risco. Uma abordagem de gestão de risco foi implementada para avaliar os controlos implementados ao longo deste projeto para proteger tanto o produto, o operador e o ambiente envolvente. O conhecimento das medidas implementadas e da sua eficácia é essencial para identificar procedimentos críticos que necessitam de ser monitorizados ao longo do tempo. Desta forma é possível eliminar potenciais falhas que possam ocorrer durante o processo de produção e implementar, caso seja necessário, novas medidas de controlo. Em último lugar, são apresentadas as conclusões deste projeto e as perspetivas futuras, uma vez que após a inspeção realizada pelo INFARMED, a Hikma 4 encontra-se aprovada para iniciar a produção de medicamentos citotóxicos liofilizados. O objetivo deste trabalho foi alcançado com sucesso. Foram definidos e implementados procedimentos para evitar a contaminação cruzada e para conter o produto, protegendo tanto os operadores como o ambiente envolvente. Desta forma, foi dado mais um passo para se iniciar a produção de medicamentos citotóxicos na Hikma 4.

Esta dissertação encontra-se dividida em duas partes. Na primeira parte, são abordados os desafios existentes na globalização da serialização e na segunda parte é descrita a realização de um estudo de avaliação da implementação da Diretiva 2011/62/UE nas farmácias portuguesas A implementação da serialização de medicamentos pode reduzir a falsificação dos mesmos. Os medicamentos falsificados são medicamentos que existem no circuito do medicamento como reais e autorizados, mas que podem conter substâncias ativas ou excipientes em doses erradas ou de baixa qualidade, podem ser rotulados de forma fraudulenta ou conter embalagens falsas. A serialização identifica cada medicamento por um número de série único permitindo que seja rastreado em todo o seu ciclo de vida, desde o fabrico à dispensa ao utente. Na União Europeia, onde se inclui Portugal, foi implementada a Diretiva 2011/62/UE e, desde 9 de fevereiro de 2019, devem ser cumpridas por todas as entidades do circuito do medicamento as obrigações legais previstas no Regulamento Delegado (UE) 2016/161 da Comissão, incluindo a obrigatoriedade prevista na Diretiva da colocação de dispositivos de segurança (Identificador Único e dispositivo de prevenção de adulterações). Em Portugal, foi aceite a introdução de um período de transição para a serialização após a entrada em vigor do Regulamento Delegado (RD), de forma a assegurar o abastecimento contínuo e regular de medicamentos no mercado nacional. A serialização foi também implementada por países não pertencentes à União Europeia. Nesta dissertação são abordados alguns países e é realizada uma comparação com a legislação existente nesses países e na União Europeia. É ainda abordado o impacto do Brexit na aplicação da Diretiva 2011/62/UE no Reino Unido. A implementação da serialização nas empresas farmacêuticas é complexa e requer um envolvimento de todos os departamentos da empresa. Apesar da serialização ter trazido vantagens para a indústria farmacêutica, trouxe também alguns obstáculos, como por exemplo, os custos associados. Após a implementação da serialização de medicamentos na União Europeia, em 2017, novos regulamentos sobre dispositivos médicos foram adotados de forma a promover a transparência e rastreabilidade dos mesmos ao longo da cadeia de abastecimento, sendo necessária a identificação única do dispositivo médico segundo as orientações internacionais. O novo regulamento deveria ser implementado até 26 de maio de 2020, mas devido à atual pandemia COVID-19 e para evitar rutura de stocks ou atrasos na disponibilidade de dispositivos médicos, foi adiado por um ano. O estudo realizado para avaliação da implementação da Diretiva 2011/62/UE teve como principal objetivo avaliar se a verificação e desativação do identificador único presente nas embalagens de medicamentos está a ser realizada corretamente. Foi elaborado um questionário e enviado a todas as farmácias comunitárias em território nacional (Portugal continental e ilhas). Os resultados obtidos foram analisados e comparados com a informação recolhida das fontes consultadas. Conclui-se que a serialização veio combater efetivamente o problema dos medicamentos contrafeitos, continuando a ser necessário educar a população e os profissionais de saúde para a deteção e comunicação dos mesmos. Seria útil implementar um sistema de serialização para todos os medicamentos, mas a sua relação custo/benefício teria de ser bem analisada e poderia não ser positiva para países desenvolvidos que possuem uma cadeia de distribuição bem regulamentada. No entanto, a existência de uma significativa circulação de medicamentos falsificados em países em desenvolvimento revela a importância da implementação do sistema de serialização nesses países.

O crescimento do mercado biofarmacêutico, o interesse em formulações de liberação controlada (CR) combinado com a produção de micropartículas à base de polímero biodegradável, como o Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) têm sido amplamente estudado para o encapsulamento de biomoléculas. Neste trabalho, duas formulações para o encapsulamento da lisozima em microesferas PLGA foram desenvolvidas e otimizadas, bem como o processo de produção baseado na técnica dupla emulsão evaporação de solvente, água-em-óleo-em-água (W/O/W). Durante o desenvolvimento do processo, foi avaliado a morfologia, a eficiência de encapsulamento (EE), a atividade proteica e a liberação da proteína das microesferas. A produção da W/O/W consiste na emulsificação da primeira fase aquosa, que contém lisozima dissolvida, com a fase oleosa, solução de PLGA, e de seguida com a segunda fase aquosa. A tecnologia de produção utilizada foi um misturador de alto cisalhamento e um liofilizador. A combinação de PVA e NaCl na fase aquosa externa (W2) mostrou-se a melhor escolha como estabilizante da emulsão. As microesferas obtidas apresentam uma forma esférica, rígidas, o EE foi de ~ 100% e a atividade da proteína foi mantida. Durante as etapas de produção, a etapa de lavagem foi otimizada até a última etapa (stage 4) onde uma superfície limpa foi alcançada. A etapa de tempering, tempo necessário para a evaporação do solvente, é uma etapa crítica para a solidificação das microesferas, sem um tempo adequado nesta etapa as microesferas iram desfazer-se quando a etapa de lavagem fosse realizada. O desenvolvimento de uma nova formulação de libertação controlada requer meses de pesquisa e estudos de libertação in vitro (IVR) para atingir o perfil de liberação desejado do medicamento. Uma Wmaneira de reduzir esse tempo é tentar prever esses dados com o mínimo de tempo experimental usando modelos empíricos ou matemáticos. A equação de Weibull, modelo empírico, consegue prever o perfil de liberação do medicamento que é controlado pela erosão do polímero juntamente com uma explosão inicial de liberação mínima e uma liberação difusiva mínima, mas dados de IVR em tempo real e acelerados são necessários. O modelo matemático selecionado, uma framework analítica, para a previsão da libertação da substância ativa de microesferas de libertação controlada baseado em valores de parâmetros da matéria-prima e do produto final (microesferas). Com base em um artigo que descreve este modelo, a implementação foi tentada sem sucesso. Apesar deste modelo se encontrar amplamente estudado mais pesquisa é necessária para ajudar a construir um modelo robusto.

No summary/description provided

No summary/description provided

No summary/description provided

No summary/description provided